Какой светофильтр лучше использовать в световом микроскопе: Светофильтры для микроскопа

Содержание

Светофильтры для микроскопа

Микроскопические исследования требуют использования разных агрегатов и дополнительных аксессуаров к устройствам. Одним из таких является светофильтр (СФ). Его применяют не только для визуальных исследований и наблюдений за объектами через увеличительное стекло окуляра микроскопа, но также и для создания микроскопических фотографий частиц препаратов.

Зачастую светофильтры сделаны из:

  • — матовых,
  • — нейтральных
  • — разноцветных стекол,

благодаря им можно избирательно снизить или вовсе заблокировать интенсивность конкретной световой волны, пропуская при этом другие волны. Благодаря светофильтрам в лабораторных условиях можно компенсировать разные отклонения и искажения в картинке, которую мы получаем на оптическом устройстве, а также минусы осветительной системы, и при этом получить на выходе наиболее четкое, качественное изображение. При этом, важно не забывать о том, что когда в оптических приборах вводят лучи дополнительных элементов, в частности светофильтрацию, это приводит к тому, что фильтр поглощает световой поток и как следствие, уменьшает освещенность образца на препаратном столе. Это может отрицательно повлиять на качество картинки, которую отобразит микроскоп. Поэтому, подбирая светофильтры, нужно устанавливать эти дополнительные аксессуары лишь в том случае, если они

действительно (!) необходимы и могут принести пользу в исследованиях.

Основная сборка любого оптического прибора включает несколько фильтров света. Зачастую исследователи сталкиваются с голубым, желтым, зеленым и матовым фильтрами.

В этой статье мы попробуем разобраться, в каких же ситуациях и как следует использовать эти аксессуары, и как они реально могут помочь в анализе препарата или образца.

Голубой светофильтр

Итак, синий фильтр света, который также иногда бывает голубым, сравнивается с дневным светом, может принести пользу при использовании в микроскопах, где образец на предметном столе освещается при помощи вольфрамовой лампы, или галогенки. В этом случае синий СФ гарантирует баланс передачи оттенков и придает картинке холодный, естественный цвет, как будто бы образец освещен обычным естественным, дневным светом. Это более четкий и комфортный для глаз вариант, так как он позволяет точно увидеть изображение без искусственного жёлтого освещения.

Галогеновые лампы и лампы накаливания в свою очередь могут менять оттенок в более теплую или холодную сторону, в зависимости от того, насколько интенсивно освещение образца на предметном столике. При этом, Если вы будете использовать светодиодное освещение, то не столкнетесь с таким недостатком. Если интенсивность освещения будет слабой, лампа будет давать красный оттенок, а если сильной — то голубой, что может в свою очередь несколько исказить цвета. Это очень весомый недостаток для тех, кто занимается микрофотографией. В результате готовые фотоснимки не отображают реальных цветов объекта изучения, и зачастую отличаются усиленными желтыми тонами, как правило, фоновыми.

Если же над линзой или в держателе фильтра конденсора в биологическом агрегате установить синий СФ, он поможет сдержать красную часть спектра, благодаря чему микроскоп покажет более естественные цвета на готовом изображении.

Создавая микроскопические фотографии, нужно не забывать о правильной передаче тонов, заблаговременно настроив баланс белого. Это делается точно по такому же принципу, как и в любом современном фотоаппарате.

Чтобы привести пример, отметим, что тонкий голубой фильтр света может увеличить температуру оттенка на 200 градусов, благодаря чему при изучении окрашенных тканей или гистологических срезов под микроскопом, появляется возможность увидеть наиболее четкое в микрофото с правильной передачей всех оттенков.

Зелёный светофильтр

Он также носит название интерференционного. Его особенности в том, что он чаще всего применяется в лабораторных микроскопах, оснащенных ахроматическими объективами. В них сферические отклонения от нормы лучше всего исправляют при помощи зелёного оттенка. Так, СФ позволяет не только улучшить четкость картинки, строящейся формируется в объективе, но также и получить микроснимок наиболее высокого качества благодаря особой конструкции фазово-контрастных объективов. На снимках будет отображена высокая контрастность при наблюдениях в зелёном поле. Хотя при этом анализ фазово-контрастных микроскопов показал, что в исследованиях могут также быть полезны и иные СФ, например, голубой или желтый.

Диффузор, или так называемый «матовый» светофильтр

Его применяют в микроскопе для того, чтобы добиться большего рассредоточения световой волны и при необходимости настройки диффузного, рассеянного света. Этот СФ, также как и синий, чаще всего применяют тогда, когда освещение образца на предметном столике достигается за счёт лампы накаливания. Также данный аксессуар может сослужить хорошую службу в ходе работы с объективами, которые не во много раз увеличивают предмет.

Матовый фильтр может применяться в роли дополнительной линзы и равномерно освещать весь объект наблюдения.

Желтый светофильтр

Его применяют для того, чтобы лучше всего настроить баланс цветов в устройствах, в которых свет источают галогеновые или лампы накаливания для создания цветных микрофотоснимков. Благодаря желтому фильтру снижается общая температура картинки, также этот аксессуар используется в ходе исследований через металлографические модели. Он позволяет заметить небольшие дефекты в структуре металлических образцов или их поверхностей.

Нейтральный светофильтр

Его зачастую используют для того, чтобы настроить время экспозиции. Чаще всего он необходим во время рабочего процесса с камерой, в которой стандартная выдержка затвора. Нейтральный СФ уменьшает яркость света в том случае, если его слишком много для того, чтобы удобно производить наблюдение или делать фотографии. Его тон — серый, благодаря чему достигается снижение яркости проходящего светового потока на отдельном участке или на всей длине светового луча, при этом, не изменяя оттеночную температуру.

Существует два вида таких светофильтров — одни из них абсорбируют свет, другие — отражают.

Светофильтры для окрашенных предметов

Образцы тканей человека, разные био-микрочастицы нередко окрашиваются специальными органическими средствами, так как это позволяет более четко увидеть эти элементы в структуре объекта. Для того, чтобы рассмотреть окрашенные частицы, лучше всего использовать компенсационный светофильтр, который в восстанавливает почти все утраченные оттенки на цветном фото. Иногда некоторые цвета могут быть блеклыми, в том случае, если они подверглись нескольким окраскам, именно тут на помощь придет соответствующий СФ.

Кроме того, окрашенные ткани на картинке микроскопа нередко бывают отображены недостаточно насыщенными и мутными, что помогает нейтрализовать дидимиевый СФ, сделанный из специального стекла. Например, светло-красный вариант дидимия включает неодим и празеодим, отлично поглощающие свет. Эти элементы присутствуют в СФ в разных долях и гарантируют приглушение всех оттенков, кроме узкой части видимого света, например, красной. В целом, эти фильтры не придают изображению насыщенности, а напротив — делают все цвета более приглушенными, кроме одного, выделяя его на фоне остальных.

Также есть так называемые поляризационные модели фильтров, поляризатор и анализатор, которые позволяют проводить анализ посредством поляризованного освещения.

Флуоресцентная версия светофильтра являет собой узкополосный фильтр, который позволяет поглотить свечение луча и защитить глаза лаборанта. Таким образом, он может видеть лишь ту часть образца, которая светится — флуоресцирует. Но об этом мы поговорим более детально в наших следующих статьях.

Как выбрать светофильтр | CameraIQ

Фильтры MidOpt являются лучшим решением для промышленной визуализации, обеспечивающим безупречный контроль, надежные результаты, непревзойденную повторяемость и исключительное качество изображения для монохромных и цветных систем видеонаблюдения. Фильтры способны блокировать весь нежелательный окружающий свет и пропускать только необходимый световой поток при одновременном повышении контрастности и разрешения. Независимо от того, считает ли ваша система зрения элементы, считывает коды или проверяет определенные объекты на наличие дефектов, оптические фильтры помогут вам создать более стабильную и точную систему. В зависимости от вашего применения доступно множество разновидностей оптических фильтров:

Полосовые фильтры

Полосовые фильтры часто являются одним из самых простых способов радикально улучшить качество изображения. Они спроектированы с гауссовой кривой пропускания для эмуляции выходного сигнала наиболее распространенных типов светодиодов, используемых в машинном зрении, и отлично подходят для тестирования эффектов монохроматического изображения. Все полосовые фильтры MidOpt имеют антибликовое покрытие для обеспечения максимальной пропускной способности.

Многополосные фильтры

Многополосные фильтры пропускают два или более определенных диапазона длин волн через один фильтр. Они обеспечивают естественную цветопередачу в дневное время и ближнюю инфракрасную подсветку ночью, обеспечивая получение точных высококонтрастных изображений. Это делает их отличным выбором для интеллектуальных решений дорожного движения, наблюдения за безопасностью и сельскохозяйственной инспекции.

Longpass Filters

Фильтры Longpass обеспечивают плавный переход от отражения к передаче и доступны во многих длинах волн, в зависимости от потребностей вашей системы. Длиннопроходные фильтры лучше всего использовать в контролируемой среде, когда необходимо пропустить несколько длин волн, и являются экономичным решением для блокирования возбуждающего света в флуоресцентных устройствах.

Shortpass / NIR Cut Фильтры

Фильтры Shortpass имеют непревзойденный переход от передачи к отражению и обеспечивают превосходную контрастность. Их лучше всего использовать в цветных изображениях для достижения естественной цветопередачи и блокирования инфракрасного насыщения.

Поляризационные фильтры

Поляризационные фильтры уменьшают отражение, улучшают контраст и обнаруживают недостатки в прозрачных материалах. Они лучше всего используются для приложений, которые имеют подавляющее отражение при осмотре объектов на блестящих поверхностях.

Фильтры нейтральной плотности

Фильтры нейтральной плотности уменьшают насыщенность света и признаны в отрасли как «солнцезащитные очки для вашей системы». Доступны как поглощающие, так и отражающие стили, и их лучше всего использовать в приложениях, где яркость слишком велика. Они служат отличным решением для управления диафрагмой объектива и увеличения глубины резкости.

Защитные фильтры

Защитные фильтры лучше всего использовать для защиты линз. Они сделаны из высококачественного полированного стекла и оптического акрила и поставляются с антибликовым покрытием для максимального пропускания. Акриловые защитные фильтры имеют стойкое к истиранию покрытие и полезны для применений FDA / EMA.

Светобалансирующие фильтры

Фильтры балансировки света используются для достижения более точной цветопередачи и снижения затрат при использовании светодиодного или металлогалогенного освещения. Блокируя большую часть синего спектра, излучаемого холодными белыми светодиодными лампами, проверяемый объект выглядит более естественным для человеческого глаза.


Выбор оптического фильтра

Чтобы выбрать подходящий светофильтр, вам нужно точно определить свою задачу или проблему с изображением, которая у вас сейчас есть. Одним из наиболее распространенных фильтров, используемых для улучшения систем зрения, является полосовой фильтр. Чтобы найти наилучший полосовой фильтр для вашего применения, используйте источник белого света широкого спектра действия и набор полосовых фильтров машинного зрения для выделения различных длин волн.

 

 

Просматривая полученное изображение, которое обеспечивает каждый полосовой фильтр, вы можете определить наилучший цвет для максимизации контраста и уменьшения мешающего света. В дополнение к полосовым фильтрам мы предлагаем множество других фильтров, которые помогают уменьшить блики, устранить насыщенность, сбалансировать цвет и многое другое. Наши специалисты помогут подобрать идеальный светофильтр подходящий для ваших задач. Отправьте запрос на сайте или свяжитесь с нами любым удобным способом.

 

 

Световая микроскопия, световой микроскоп — Справочник химика 21

    Наряду с изучением рассеяния света дисперсной системой в целом применяются также методы, основанные на регистрации рассеяния (дифракции) света на единичных частицах. Этот метод — ультрамикроскопия — имел большое значение в развитии коллоидной химии. Для наблюдения рассеяния света отдельными частицами применяются оптические системы с темным полем. К их числу относятся ультрамикроскопы, в которых интенсивный сфокусированный световой поток направляется сбоку на исследуемую систему, а также конденсоры темного поля, которые используются в обычных микроскопах для создания бокового освещения. Регистрация светящихся точек, хорошо видимых на темном фоне и представляющих собой свет, рассеянный (дифрагированный) отдельными частицами, позволяет определить концентрацию частиц дисперсной фазы, наблюдать флуктуации их концентрации и броуновское движение. Такие опыты, проведенные Перреном, Сведбергом и рядом других ученых, явились подтверждением правильности теории броуновского движения (см. гл. V) и молекулярно-кинетической концепции в целом. С. И. Вавиловым был разработан иной метод изучения броуновского движения. В этом методе производилась фотосъемка частиц дисперсной фазы, находящихся в броуновском движении. Перемещение частиц приводило к тому, что их изображения на пластинках имели вид размазанных пятен в полном согласии с теорией броуновского движения средняя площадь этих пятен оказалась пропорциональной времени экспозиции. В этом методе удается фиксировать одновременно несколько частиц, что облегчает получение необходимого для статистического усреднения большого количества экспериментальных результатов. [c.171]
    Принципиальная схема светового микроскопа представлена на рис. V. 1 а. Обычный микроскоп представляет собой двухступенчатый оптический увеличитель. В нем имеется система линз, называемая объективом 4, которая проектирует увеличенное изображение объекта S. Это промежуточное изображение 5 увеличивается другой системой линз — окуляром 6, через который ведет наблюдение исследователь. Объектив и окуляр помещены в тубусе микроскопа на одной оптической осн. Для устранения нежелательных дифракционных эффектов и обеспечения должной разрешающей способности предназначена система линз конденсора 2, благодаря которому пучок света от лампы / концентрируется в плоскости исследуемого объекта. Конечное изображение 7 регистрируется на фотопластинку 8. [c.248]

    В 1903 г. Р. Зигмонди и Г. Зидентопф предложили оптический метод изучения систем, содержащих частицы коллоидных размеров. По этому методу, называемому ультрамикроскопией, наблюдается свет, рассеянный одиночными частицами. Этот метод можно сравнить с наблюдением за движением отдельных пылинок, попавших в солнечный луч в темном помещении. Схема предложенного Зигмонди и Зидентопфом щелевого микроскопа показана на рис. 67. Свет от дуговой лампы фокусируется линзами в системе, частицы которой рассеивают свет. Чтобы выделить небольшое поле зрения под микроскопом, используется раздвижная щель, позволяющая вводить в изучаемый объект пучок света высотой в несколько микрометров. В ультрамикроскопе Зигмонди и Зидентопфа оптическая ось микроскопа перпендикулярна вводимому в объект лучу света. Э. Коттон и А. Мутон в 1903 г. сконструировали прибор, в котором направление светового луча и оптическая ось микроскопа совпадают. Для обеспечения темного фона в их приборе используется эффект полного внутреннего отражения. [c.162]

    Несмотря на некоторую общность оптической схемы, условия формирования изображения в световом и электронном микроскопах принципиально различны. В световом микроскопе изображение получается, главным образом, вследствие различной поглощающей способности световых лучей отдельными элементами объекта. Многие препараты, особенно биологические, во всех своих частях одинаково прозрачны для видимого света, поэтому их наблюдение в микроскопе затруднено. Если предварительно избирательно окрасить объект, то он начинает поглощать больше света по сравнению с окружающим бесцветным фоном и становится ясно видимым. В электронном микроскопе объект не должен заметно поглощать электроны. Взаимодействие электронов с объектом должно носить характер упругих столкновений, т. е. энергия электронов при прохождении через объект не должна существенно изменяться. Формирование контраста изображения связано с разной степенью рассеивания электронов различными участками объекта. [c.171]


    Методы световой микроскопии классифицируют по способам освещения объектов исследования. Освещение в проходящем свете применяется при рассмотрении деталей тонких объектов, которые должны быть илп окрашенными, или, если они не поглощают света, отличаться по показателю преломления от той среды, в которую помещены, хотя бы на 0,1. Для исследования многих объектов лучше применять микроскопию с использованием падающего света (в отраженном свете). Для исследования непрозрачных объектов 8T0 единственно возможный метод. Боковое освещение является [c.248]

    Ультрамикроскоп не позволяет судить о форме и размерах коллоидных частиц, так как его разрешающая способность ограничена слишком большой для этого длиной волны видимого света. Для желаемой характеристики коллоидных частиц необходим прибор, работающий с более коротковолновыми лучами. Таким оказался электронный микроскоп, действие которого основано на использовании пучка электронов, получаемых в специальной катодной трубке и разгоняемых электрическим полем. Если длина волны светового луча, используемого в ультрамикроскопе, равна 500 нм, то длина волны электронного луча, используемого в электронном микроскопе, составляет 0,5 нм. В соответствии с этим, разрешающая способность электронного микроскопа в 1000 раз выше, чем у ультрамикроскопа. Это позволило глубоко проникнуть вглубь материи наблюдать отдельные группы молекул, исследовать структуру катализаторов, изучать строение молекул полимеров (например, белковых веществ) и т. д. [c.277]

    Границы световой микроскопии определяются величиной ее разрешающей силы, равной 1/3 длины волны падающего излучения. В белом свете она лежит примерно при 200 нм. [c.155]

    Теория показывает, что разрешающая способность микроскопа, т. е. то наименьшее расстояние, при котором две точки можно еще видеть отдельно друг от друга, составляет около половины длины световой волны. Таким образом, при использовании обычного света (длина волны 400—700 нм) в наилучший микроскоп видимы частицы, размер которых составляет не менее 0,2 мкм. При использовании ультрафиолетового света с помощью фотосъемки можно получить изображение более мелких частиц, но с диаметром все же не меньшим 0,1 мкм. Таким образом, коллоидные частицы лежат за пределами видимости в обычном микроскопе. [c.44]

    Изучение рассеяния света важно для суждения о величине и форме частиц коллоидной дисперсности, которые слишком малы для непосредственного исследования их с помощью обычного микроскопа. На явлении рассеяния света основан ряд методов определения размера и формы частиц с использованием ультрамикроскопа, фотоэлектроколориметра, нефелометра и поляриметра. В ультрамикроскопе каждая частица обнаруживается в отдельности в виде светящейся точки или системы дифракционных колец. В остальных методах величина частицы оценивается на основании измерений интенсивности светового потока и степени поляризации в различных направлениях при рассеянии света в мутной среде. В совокупности эти методы дают возможность составить более или менее ясное представление и о форме частиц. [c.30]

    Коллоидные растворы представляют собой ультрамикрогетерогенные системы обычно типа Т — Ж, т. е. твердое тело, раздробленное в жидкости. Размер коллоидных частиц лежит в пределах —100 нм, и именно в связи с такой высокой степенью дисперсности гетерогенность коллоидных растворов нельзя обнаружить с помощью обычного микроскопа. В связи с гетерогенностью коллоидные растворы рассеивают свет. Если наблюдать коллоидные растворы в проходящем свете, то они кажутся совершенно прозрачными. Но при боковом освещении они оставляют на пути прохождения пучка света на темном фоне световой след. Световые лучи рассеиваются коллоидным раствором во всех направлениях, и в частности попадают в [c.383]

    Объективы современных световых микроскопов имеют апертурный угол, близкий к 90°. Следовательно, при показателе преломления, равном 1, и при использовании лучей видимого света, например сХ = 4500 А, разрешаемое расстояние составляет  [c.167]

    Иная картина в коллоидных системах. Размеры коллоидных частиц меньше длины волны падающего света. Световые лучи не могут отражаться от таких частиц, и поэтому коллоидные частицы невидимы даже в самые сильные оптические микроскопы. Светорассеяние в коллоидных системах вызвано явлением дифракции, которое заключается в том, что лучи света огибают коллоидные частицы и изменяют свое направление, рассеиваясь во все стороны. [c.36]

    Ультрамикроскопия. Коллоидные частицы, имеющие диаметр меньше половины длины световой волны, не могут быть видимы в обычные микроскопы. Причина этого заключается в том, что световые волны огибают коллоидные частицы, а рассеиваемая часть света настолько мала, что не воспринимается глазом, тем более в условиях проходящего освещения. [c.127]


    Эксперименты проводят по следующей схеме (см. рис. 29). В стенках трубы предварительно сделаны остекленные отверстия, что дает возможность пропускать сквозь покрытие пучок света с помощью зеркала, установленного на подставке в трубе. Сверху световой пучок воспринимается объективом поляризационного микроскопа, установленного непосредственно на трубе [c.91]

    На рис. 72 показаны направление световой полосы и направление наблюдения профиля. Для наблюдений удобнее всего использовать микроскоп. Специальная аппаратура позволяет направить плоский тонкий пучок света наклонно по отношению к исследуемой поверхности и рассматривать линию профиля под определенным углом. При использовании специального объектива можно достаточно точно определять глубину коррозионных язвин и питтингов (в пределах [c.224]

    Микроскопический метод исследования с помощью светового потока. Направляя луч монохроматического света через специальную линзу микроскопа на отражающую плоскую поверхность металла под углом 45°, с помощью другой линзы можно наблюдать отраженное изображение. При неровной поверхности световые лучи отклоняются на величину, пропорциональную высоте неровностей поверхности. Таким образом, если с небольшой площади поверхности полностью удалить металлическое покрытие и направить на этот участок луч света, то отклонение луча даст абсолютную величину толщины покрытия. В случае прозрачных покрытий, т. е. неметаллических (таких, как чистые оксидные покрытия, образуемые анодным окислением алюминия), получают отражение от поверхности как покрытия, так и основного металла, без снятия покрытия. Данный метод не приводит к нарушению покрытия. [c.140]

    Интерферометрический метод. В этом оптическом методе применен луч монохроматического света, который направлен на границу между покрытием и основным слоем точно таким же образом, как в микроскопическом методе исследования с помощью светового потока. Но вместо измерения отношения отраженного луча микроскоп используется для установления количества интерференционных колец, создаваемых при рассеивании света под действием уступа на границе покрытия. Число колец, умноженное на половину длины волны использованного светового луча, составляет толщину покрытия. [c.140]

    Перрену удалось подсчитать коллоидные частицы оптическим методом, хотя, как правило, они настолько малы, что их нельзя заметить при наблюдении в обычный микроскоп. Успех эксперимента Перрена обязан эффекту Тиндаля, который представляет собой рассеяние света коллоидными частицами. Если частицы освещаются светом, направленным приблизительно под углом 90° по отношению к линии наблюдения, рассеянный ими свет зрительно воспринимается как световые пятнышки, которые нетрудно наблюдать в микроскоп при умеренном увеличении (приблизительно 200 х ). Этим способом можно отличить золь от молекулярных или ионных растворов последние не способны рассеивать свет. [c.500]

    Световая микроскопия относится к визуальным методам, основанным на использовании электромагнитных колебаний с длиной волны, намного меньшей размеров изучаемого объекта. Применительно к полимерам метод позволяет определить размеры и форму надмолекулярных образований не менее 0,4 мкм, поскольку использует длину волны видимого света (0,4-0,8 мкм), и применяется для изучения морфологии поликристаллов, изучения толщины и поперечного сечения образцов. Этим методом можно изучать распределение концентрации и ориентацию наполнителя (в том числе, резины как наполнителя для других полимеров), взаимодействие между резиновой матрицей и наполнителем, исследовать поверхность резин. [c.195]

    Световая микроскопия сегодня чаще всего использует поляризованное излучение, поскольку кристаллизация и ориентация обусловливают эффект двойного лучепреломления. В частности, для получения информации об упорядоченном состоянии надмолекулярных образований предлагается [6] использовать экспериментальную зависимость рассеяния поляризованного света от величины угла рассеяния. [c.354]

    Качество изображения может быть улучшено за счет спектрального изменения светового потока в микроскопе, достигаемого применением светофильтров. Контрастные фильтры позволяют повышать контрастность окрашенных объектов кристаллы, имеющие одинаковую с фильтром окраску, будут иметь светлый оттенок, а кристаллы, окрашенные в цвет, дополнительный к цвету фильтра, — в темный тон. При использовании контрастных светофильтров целесообразно применение панхроматических фотоматериалов. Для уменьшения силы светового потока (яркости изображения) в соответствии с чувствительностью фотоматериала применяют различные компенсационные фильтры светоослабляющие, фильтры дневного света, теплозащитные и специальные желто-зеленые фильтры. Все эти фильтры обладают небольшим собственным поглощением света, поэтому при цветной микрофотографии их следует применять с учетом этого обстоятельства. Для выделения из видимой части спектра нужного излучения применяют избирательные фильтры — синий, зелеьый, желтый, оранжевый и красный. Эти фильтры используют в специальной флюоресцентной микроскопии. Зеленые фильтры, устраняющие остаточную аберрацию ахроматических объективов, называются корригирующими фильтрами и применяются для повышения контрастности изображения. Синие фильтры повышают разрешающую способность микроскопов. [c.117]

    Использование когерентного излучения позволило создать принципиально новый метод проекционной микроскопии, основанный на применении квантовых усилителей света. Объект с помощью объектива освещается монохроматическим светом от лазера на парах меди. Офаженный от объекта свет проходит активную среду, усиливается и проектируется на экран. Когерентные микроскопы обеспечивают высокое просфанственное разрешение (1 мкм при увеличении порядка 1000. ., 1500) при яркости изображения, недоступного обычным световым микроскопам. Особенностью микроскопа являются возможность фокусировки мощного лазерного излучения на любом элементе объекта и возможность осуществлять его коррекцию. [c.509]

    При осмотре поверхности для определения блеска при помощи светового или электронного микроскопа в поле зрения попадает очень малая часть поверхности, в то время как человеческий глаз оценивает общую поверхность. Поверхность, называемая гладкой, содержит шероховатости порядка тысячных долей миллиметра. От нее отражается рассеянный свет. Доля рассеянного отраженного света будет тем меньшей, чем больше сняты микрошероховатости, т. е. в среднем размеры их должны быть доведены по крайней мере до величины меньшей, чем длина наиболее короткой световой волны, равной 0,4 мкм. Следовательно, при электролитическом осаждении блестящих металлопокрытий кристаллизация должна идти в таком направлении, чтобы были удалены эти микрошероховатости поверхности. Напротив, макрошероховатости, величина которых значительно больше длины световой волны, могут встречаться при блестящих покрытиях. [c.59]

    Факты основываются на прямьк или косвенных наблюдениях, выполненных с помощью органов чувств или приборов, таких как свето- или радиотелескопы, световые и электронные микроскопы, осциллофафы, действующих как усилители нащих чувств. Все факты, относящиеся к конкретной проблеме, называются данными. Наблюдения могут быть качественными (т. е. описывать цвет, форму, вкус, внещний вид и т. д.) или количественными. Количественные наблюдения являются более точными. Они включают измерение величины или количества, наглядным выражением которых могут служить качественные признаки. [c.377]

    Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный световой микроскоп, но здесь свет от осветителя, излучаемый мощным источником, проходит через два набора фильтров — один для задержания света перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образна Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает на окуляр свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции (рис. 4-6). Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Например, флуоресцирующие красители могут быть связаны с молекулами антител, что сразу же превращает их в высокоспенифические и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со специфическими макромолекулами на поверхности живой либо внутри фиксированной клетки (см. разд. 4.5.3). Для этой цели обычно используют два красителя — флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом (рис. 4-7). Применяя [c.177]

    Общая схема просвечивающего электроппого микроскопа (ПЭМ) напоминает схему светового, хотя электронный микроскоп значительно больше и как бы перевернут (рис. 4-13). Источник излучения — нить катода, испускающая электроны с вершины цилиндрической колонны высотой около двух метров. Поскольку при столкновении с молекулами воздуха электроны рассеиваются, в колонне должен быть создан вакуум. Электроны, излучаемые катодной нитью, ускоряются ближайшим анодом и проникают через крошечное отверстие, формируя электронный луч, проходящий в нижнюю часть колонны. Вдоль колонны на некотором расстоянии расположены кольцевые магниты, фокусирующие электронный луч, подобно стеклянным линзам, фокусирующим луч света в световом микроскопе. Образец через воздушный шлюз помещают в вакуум колонны, на пути электронного пучка. Часть электронов в момент прохождения через образец рассеивается согласно плотности вещества в данном участке, остаток электронов фокусируется и образует изображение (подобно формированию изображения в световом микроскопе) на фотопластинке или на фосфоресцирующем экране. [c.181]

    Протобиополимеры, синтезированные в условиях холодной плазмы, и в особенности смеси, богатые липидными структурами, во время размораживания претерпевают самосборку в стабильные микросферы, однородные по размерам (диаметр 10— 50 мкм) (рис. 62). Для их изучения были использованы следующие методы оптическая микроскопия электронная микроскопия (срезы и цельные микросферы) оптическая микроскопия в поляризованном свете растровая электронная микроскопия (РЭМ) электронная микроскопия по методу замораживания — скалывания проверка на устойчивость к термическому и световому воздействию проверка на устойчивость к изменениям pH испытание механической прочности исследование мембранных свойств изучение связывания биологически активных соединений. [c.95]

    Мезофазные сферы в момент их возникновения и при последующем росте, по данным световой микроскопии в поляризованном свете, а также дифракционного и рентгеноструктурного анализов, являются оптически одноосными положительными кристаллами гегсагональной системы. Показанные на рис. 2-4, а изгибы слоев приводят к тому, что на краях они перпендикулярны к касательной поверхности сферы. Это, по-видимому, способствует начальной коалесценции. В условиях относительно низкой подвижности мезофазы и случайной взаимной ориентации коалесцирующих сфер образования простой слоистой структуры не происходит. При этом возникают структуры, отличающиеся множеством дефектов упаковки слоев линейных, изгибов, нарушений непрерывности. Исследования профилей рефлексов (002) рентгенограмм мезофазы с учетом эффектов гьбсорбции и поляризации рентгеновских лучей, а также фактора рассеяния атомов углерода показывают, что средние значения межслоевого расстояния 002 равны примерно 0,350 нм [2-89]. Отдельные пачки слоев с разными значениями межслоевого расстояния имеют размеры до 2 нм. При нагревании сферы мезофазы могут расщепляться и приобретать относительно плоскую конфигурацию. То же происходит и при графитации мезофазы. Флуктуация межслоевых расстояний у графитирующейся мезофазы наивысшая. [c.46]

    Макро- и микроструктура коксов оценивается с помощью световой микроскопии в основном в поляризованном свете, а также сканирующей и просвечивающей электронной микросконии. [c.55]

    Взаимодействие света с веществом зависит от соотношения длины волны света и размеров частиц, на которые падает световой поток. Это взаимодействие происходит по законам геометрической оптики (отражение, преломление), если размеры объекта больше длины волны света. Если размеры частиц меньше половины длины волны света, то происходит рассеивание света в результате его дифракции. Область видимого света характеризуется длиной волн от 760 до 400 нм. Поэтому в молекулярных и коллоидных системах видимый свет рассеивается, а в проходящем свете эти растворы прозрачны. Наибо.льшей интенсивности рассеивание света достигает в коллоидных системах, для которых светорассеяние является характерной качественной особенностью. Обнаружение в растворе пути луча источника света при рассматривании раствора перпендикулярно к направлению этого луча позволяет отличить коллоидный раствор от истинного. На этом же принципе основано устройство ультрамикроскопа, в котором наблюдения проводят, в отличие от обычного микроскопа, перпендикулярно направлению проходящего через объект света. Схема поточного ультрамикроскопа Б. В. Дерягина и Г. Я. Власенко приведена на Рис. 10.6. Схема поточного ультрами-рис. 10.6. с помощью этого прибора кроскопа В. В. Дерягина и Г. Я. Вла-определяют концентрацию дисперс- сенко 1 — кювета 2 — источник света ных частиц в аэрозолях и коллоид- 3 — линза 4 — тубус микроскопа, ных растворах. [c.297]

    В качестве светового микроскопа применяется исследовательский микроскоп — вариант прибора Zetopan, дающий возможность проводить исследования в проходящем или отраженном свете в светлом и темном поле, при фазовом контрасте, поляризации света и флюоресценции. С помощью прибора можно идентифицировать частицы, определить их количество, площадь и длину, про- [c.129]

    Методы световой микроскопии различаются по способу освещения объекта исслс.аования в проходящем свете, в отраженном, свете (для непрозрачных объектов). при боковом осветег ич (ультра-микрпскопия). Эти методы пригодны для дисперсионного анализа порошков, суспензий, эмул1-сий, пен, аэрозолей. [c.392]

    Разрещаемое расстояние светового микроскопа можно снизить до 1000 А, если увеличить показатель преломления среды между предметом и объективом или проводить измерения в ультрафиолетовом свете. Для дальнейшего снижения разрешаемого расстояния [c.167]

    Как видно из рис. VI. 16 и в, оптическая схема электронного микроскопа просвечивающего типа в основных чертах напоминает оптическую схему обычного светового микроскоца (рис. VI. 1а) с тем отличием, что в электронном микроскопе источник света заменен источником электронов, а стеклянные линзы — электромагнитными или электростатическими. Электронные лучи создаются и формируются специальной электронно-оптической системой, которая называется электронной пушкой. Нагретая до высокой температуры вольфрамовая пить 1 (рис. VI.16 и й) эмитирует электроны, которые, попадая в ускоряющее поле электронной пушки, образуют пучок. В центре анода имеется небольшое отверстие, через которое пролетают электроны, используемые в дальнейшем для образования изображения. Далее электронный пучок попадает в конденсорную линзу 2, которая фокусирует его на исследуемый объект 3. Пройдя через объект, электронные лучи попадают в поле объективной линзы 4, которая создает промежуточное изображение 5, а затем в проекционную линзу 6, направляющую электронные лучи на флюоресцирующий экран и образующую конечное изображение 7. Флюоресцирующий экран покрыт веществом, способным светиться под действием ударов электронов (сульфид цинка, сульфид кадмия). Благодаря этому электронное изображение превращается в световое и становится видимым. Электронное изображение может быть зафиксировано на фотопластинке. [c.170]

    В первой группе методов измеряют линеЙЕСые размеры частиц (или пор) с помощью оптич. микроскопа (обычно реализуемый предел измерений-от 1 мкм до неск. мм) или электронного микроскопа (от 1 нм до неск. мкм) изменения электрич. сопротивления, или светового потока при про пускании суспензии через тонкий канал, вызванные попа данием в этот канал частицы дисперсной фазы (т. наз счетчики Культера позволяют измерять размеры частиц от 0,1 до 100 мкм, оптич. приборы-от 5 до 500 мкм) интенсивность света, рассеянного единичной частицей, с по мощью ультрамикроскопа или поточного ультрамикроско па Дерягина-Власенко (частицы размером от 2 до 500 нм). [c.78]

    В основе У. лежит дифракция света на колловдных частицах, размер к-рых меньше половины длины световой волны, в результате чего система начинает светиться. Частицы можно наблюдать в УМ как яркие дифракц. пятна, изучать их природу, оценивать концентрацию, однако изображений частиц микроскоп не создает. Яркость свечения, а следовательно, и видимость частиц зависят от разности показателей преломления частицы и дисперсионной среды. Если она велика (напр., взвесь металлич. частиц в воде), то отчетливо фиксируются частицы размерами 2-4 нм (т.е. значительно меньше предела разрешения обычных микроскопов). Если эта разность мала (взвесь орг. частиц в воде), то обнаруживаются только частицы размерами не менее 20-40 нм. В лиофильных коллоидах (напр., гелях желатины, декстрина) пов-сть частиц вследствие сольватации не обладает заметной разницей в показателях преломления относительно дисперсионной среды (воды), поэтому свечение в них знач1ггельно слабее. [c.36]

    Схема, предложенная Бэрчем [46] для интерференционной голографии прозрачных объектов, позволяет получить интерференционную голограмму фазового объекта при однократной экспозиции, но качество таких интерферограмм ниже, чем прп использовании двухступенчатого метода. Интерферометр Бэрча работает как интерферометр с диффузным стеклом его характеристики подобны характеристикам дифракционного интерферометра, описанного Краусхаром. Параллельный световой пучок малого диаметра, испускаемый лазером, расширяется вогнутой линзой (или объективом микроскопа). Мнимая фокальная плоскость этого расходящегося пучка проецируется в плоскость исследуемого участка t—1 линзой L и объективом ь Пучок частично рассеивается диффузным стеклом 5Р, расположенным в фокальной плоскости объектива 1 и выполняющим функцию делителя светового пучка. Основной пучок (сплошные линии) минует фазовый объект и используется в качестве сравнительного иучка. Рассеянный свет (штриховые линии) проходит через фазовый объект, в котором происходит сдвиг фаз. Фотопластинка НР, на которую фотографируется голограмма, расположена в фокальной плоскости объектива Ьо. Плоскость диффузного стекла проецируется на плоскость фотопластинки объективами Ь и Ьо. Комбинация лучей основного пучка и дифрагировавшего света со сдвигом фаз дает интерференционную голограмму. Чтобы получить интерференционную картину, проявленную голограмму устанавливают на прежнее место в оптической системе (без фазового объекта). Линза съемочной камеры, например Ьз, воспроизводит интерферо1рамму в илоскости изобра- [c.80]

    В этом приборе (рис 7 4) световой пучок от источника 5 направпен под прямым углом к оси микроскопа а сам аэрозоль движется ламинарно по трубке Т Наблюдатель видит вспышку света когда частица пересекает освещенную зону в одну минуту можно сосчитать до 100 вспышек Скорость аэрозоля вдоль оси трубки вычисляется по обьемнои скорости потока, а поперечное сечение [c.235]

    Применяемая аппаратура сходна с аэрозольным ультрамикроскопом или с конденсатором Милликена приченявшимся в его классической работе по изме рению заряда электрона Частицы освещаются интенсивным пучком света про шедшим через тепловой фильтр и рассматриваются через горизонтальный ми кроскоп под прямым углом к световому пучку В окуляр микроскопа (обычно шестикратный) помещается микрометр с параллельными штрихами и отмечается врепя прохождения оседающей частицеи определенного расстояния Затем по уравнению Стокса — Канингэма вычисляется размер частицы [c.240]

    Разрешающая способность микроскопа, т. е. наименьшее расстояние, при котором две точки еще можно видета раздельно, составляет около половины длины световой волны. Таким образом, при использовании обычного света (длина волны 400-700 нм ) даже в наилучший микроскоп видимы частицы, размеры которых не менее 2 10г см, т. е. коллоидные частицы лежат за пределами видимости в обычном микроскопе. [c.94]

    Определить их месторасположение под световым микроскопом можно посредством сыворотки, связанной с флюорохромом (флюоросцеин, родамин), который испускает зеленый или красный свет после возбуждения облучением с точно установленной длиной волны. [c.128]

    Даже иммерсионные микроскопы (разрешающая способность 0,2 нм) не всегда дают возможность визуально обнаружить частицы дисперсной фазы в коллоидных растворах. В то же время поперечник частиц в золях уже настолько велик (больше 7г световой волны), что свет не может свободно проходить через них и подвергается большему или меньшему рассеянию. Благодаря светорассеянию золи характеризуются феноменом Тиндаля и всегда, особенно в отраженном свете, кажутся опа-лесцирующими, мутноватыми или просто мутными. [c.186]


Звездные светофильтры / Fotorox.ru

Звездные светофильтры

  Светофильтр – интересный девайс, способный преобразить любую фотографию. Звездный фильтр – один из наиболее оригинальных и необычных светофильтров. Он незаменим при ночной съемке, так как превращает скучные пятна света фонарей в настоящие звезды.

  Звездный фильтр создает этот эффект благодаря нанесенной на него микроскопической сетки, состоящей из пересекающихся параллельных линий. Звездный светофильтр может преображать свет в четырех-, пяти или – шести лучевые звезды, иногда даже восьмилучевые. Это зависит как раз от этой решетки линий. Чтобы определить силу эффекта, нужно экспериментировать со значением диафрагмы.

  Как получить идеально ровные и яркие звезды? Прежде всего, помните, что яркость и величина звезды определяется яркостью источника света. Перед нажатием на спуск затвора повращайте звездный фильтр. Будет лучше, если лучи будут расположены по диагонали, а не вертикально или горизонтально – так более естественно.

  Звездный фильтр можно использовать не только ночью. Его можно применять, например, ранним утром, для съемки капель росы на траве, которые такой светофильтр превращает в маленькие звездочки. Еще звездный фильтр способен украсить зимние пейзажи с искрящимся на солнце снегом. А если вы находитесь в лесу в солнечный день – снимайте солнце, пробивающееся сквозь листву деревьев – у вас получится красивая светлая звезда на фоне зелени.

  Лучевой фильтр, по сути, тот же светофильтр, что и звездный. Он обычно преобразовывает различные источники света в разноцветную вспышку, так как разбивает световой спектр. Лучевой фильтр создает длинные пучки света, похожие на лазерные лучи. Такой светофильтр еще называют «взрывающаяся звезда». Чтобы эффект был более впечатляющим, нужен прямой источник света и темный фон. Не забывайте вращаться лучевой фильтр и следить за значением диафрагмы.

   Полезные советы, как использовать звездный (лучевой) фильтр:

 — выставляйте диафрагму в средние значения, примерно 5.6 – 8, или открывайте еще шире,  — не надевайте звездный фильтр на широкоугольный или сверхширокоугольный объектив – лучи по краям кадра могут некрасиво изгибаться,  — откажитесь от автоматической фокусировки в пользу ручной,  — вращайте звездный светофильтр, пока не достигнете желаемого эффекта,  — располагайте лучи звезд по диагонали,  — старайтесь снимать в условиях хорошей освещенности,  — для начала выбирайте лучевой фильтр, дающий эффект четырех- или шести- лучевой звезды – создавать восьмилучевые звезды сложнее.

Биологический микроскоп | Микроскопия — Микросистемы


Прямой лабораторный микроскоп CX43

Доступно: светлое поле (BF), тёмное поле (DF), флуоресценция (FL), поляризация (POL), фазовый контраст (PH)

Прямой исследовательский микроскоп BX63

Доступно: светлое поле (BF), тёмное поле (DF), флуоресценция (FL), поляризация (POL), ДИК (DIC), фазовый контраст (PH)

Инвертированный микроскоп IX73

Доступно: светлое поле (BF), флуоресценция (FL), контраст Хоффмана (RC), ДИК (DIC) фазовый контраст (PH)

      В биологии используются различные микроскопы с эндоскопическим (проходящим) освещением. Есть работы, подразумевающие пользование ртутных ламп, LED, лазеров, иного источника возбуждающего света для флуоресценции окрашенных образцов. Крайне редко применяются микроскопы с эпископическим (отражённым/падающим) освещением, потому что круг их применения ограничивается изучением поверхности, непрозрачных, пористых объектов, например, чешуи, костной, зубной ткани, раковин мелких моллюсков, ракообразных, некоторых водорослей. Исследовательское оборудование всегда сочетает в себе несколько видов освещения, между ними должно быть удобно переключаться. 

Отличительные особенности биологического микроскопа:

  • эндоскопическое освещение, для изучения прозрачных, полупрозрачных объектов

  • флуоресцентная лампа, для дифференциальной визуализации окрашенных клеток

  • большинство наблюдений в светлом поле, тёмном, с иммерсией

  • зажимы для лабораторной посуды или предметных стёкол

  • инкубационные камеры и работа с культурами in-vitro

  • микроманипуляторы для ЭКО и других исследований

  • множество светофильтров

  • конденсор с различными вставками и режимами освещения

  • инкубационные камеры для роста клеток

 

У таких приборов есть два основных вида компоновки: прямые и инвертированные

В первом случае, Вы сможете легко смотреть препараты на предметных стёклах в максимальном, доступном оптике, увеличении. Этот микроскоп применяют в школах, университетах, училищах, дома, поэтому каждому человеку интуитивно понятна логика перемещения образца и необходимая подготовка стёкол. Используя инвертированную компоновку можно просматривать живые культуры, колбы, чашки, флаконы, планшеты с лунками, микробиологические матрацы, не опасаясь касания биоматериала, не нужно думать о загрязнении, повреждении чечевиц.

 

Ранее применялись государственные стандарты для подбора микроскопа под определённые задачи

 

ГОСТ 8284-78 – «Микроскопы световые биологические. типы, основные параметры и размеры» – недействителен.

ГОСТ 8211-56 – «Микроскопы биологические. Столики предметные. Размеры и расположение отверстий под приспособления» – недействителен.

ГОСТ 8284-67 – «Микроскопы биологические. Типы. Основные параметры и размеры» (Указатель 1980 «Государственные стандарты СССР. Том 3») – недействителен.

В настоящее время, руководствуются отраслевыми стандартами, написанными научно-исследовательскими центрами, предприятиями, подразделениями академии наук и её членами. Требования к оборудованию не содержат информации о моделях, производителях, материалах изготовления, характеристиках оптических систем. В общих чертах, указываются только методы контрастирования, кратность увеличения и вид микроскопа. Этого недостаточно, для точного подбора оборудования, в виду невозможности определить: 

  • наблюдаемое линейное увеличение, не зная кратности окуляров
  • разрешение оптической системы
  • типа коррекции оптической системы
  • спектральный диапазон пропускания фильтров
  • тип и характеристики лампы.

Даже зная всё вышеперечисленное, остаётся набор строго индивидуальных требований, которые предъявляют пользователи к своему рабочему месту.

Какой микроскоп нужен для биологии?


Начнём с самых простых задач, для которых понадобится лабораторный прямой микроскоп, например, Olympus CX43. Используется для исследований: анализа спермы (клеточных элементов эякулята), неклеточных элементов, осадка мочи, нативных препаратов крови, активного ила, поперечных срезов филаментов, микрофлоры в мазках, планктона и список можно продолжать до бесконечности.


Рисунок 1. Примеры снимков на LC30 с микроскопа CX43

Область применения микроскопа в биологии зависит от коррекции объективов. Обратите внимание на снимки снизу. На фотографиях ниже запечатлены водоросли. Съёмка проводилась через планахромат PLAN C.


Рисунок 2. Сравнение объективов с коррекцией планахромат и ахромат

А что будет, если установить биологические объективы PLAN C в микроскоп классом выше, например, BX43? Посмотрите на рисунок снизу, сразу станет понятно, что для большей детализации, нет необходимости сильно закрывать диафрагму и терять в освещённости.


Рисунок 3. Olympus PLAN 20x NA=0.40 в BX43

 

Для серьёзных биологических исследований, флуоресценции и ДИК используйте исследовательские микроскопы

 

Прямую компоновку предпочтительно применять биологам, занимающимися флуоресцентными наблюдениями. Разберём по порядку. Флуоресценция применяется для анализа, меченных флуорофором, участков молекул, наблюдения и регистрация сегментов хромосом. Преимуществ много, специфичность высокая и для пропускания УФ излучения требуется низкодисперсное стекло или кристаллы. Раньше использовали кристаллы флюорита, из-за чего класс оптики получил своё наименование – Fluorite. Сложная оптика дополняется непростой системой фильтров, позволяющих рассматривать образцы, окрашенные несколькими красителями одновременно. Для достоверных результатов необходимо равномерное освещение образца, обеспечивающее одинаковую резкость по всему полю зрения. Такую равномерность обеспечивают линзы структурно похожие на пчелиные соты.

 

Дифференциально интерференционный контраст (ДИК) в биологии

Это интересная современная разработка, передающая псевдорельеф изображения. Если Вы никогда раньше не использовали этот контраст, то представьте совмещение поляризации и фазового контраста. Получаемые окрашенные изображения, дают ценную информацию при исследовании живой материи. Из-за поляризационной картины напряжений не стоит применять пластиковую посуду, искажающую его, гораздо лучше подойдёт стекло. Дополнительные компенсаторы, λ-пластинки, могут усиливать, либо ослаблять рельефность изображения.

 

Поляризационные биологические исследования

Поляризацию используют во множестве прикладных наук, в том числе – биологии. Основные приёмы работы нужно почерпнуть из пособий по кристаллографии. Применяется для поиска оптических неоднородностей, определения стороны поляризации, диагностики кристаллов. Конкретика: для анализа подагры применяют поворотный поляризатор, λ пластинку и поворотный анализатор. Диагностируется болезнь по наличию кристаллов урата, с характерным негативным двулучепреломлением и свечением в скрещенных николях (поляризаторе/анализаторе). Есть специальные анализаторы для CX43 с U-GAN, где не требуется дополнительная λ пластина и вам необходимо вращать только поляризатор. Это значительно экономит время и снижает требования к специалисту. Это частный пример определения концентрации оптически активных веществ в биологических растворах, не менее распространено определение минералов примесей в растительном сырье. Для сложных почвенных экспертиз пользуются BX53P, это биологический современный поляризационный микроскоп с ортоскопией и коноскопией. Коноскопия – поляризационные наблюдения в сходящемся свете, прекрасно подойдёт, если необходимо диагностировать минералы в почве, потому что при скрещивании анализатора и поляризатора, лучи, прошедшие через линзу Бертрана, не дают картинку минерала, а представляет интерференционные эффекты, коноскопические фигуры, по которым определяют количество осей, оптический знак, относительную величину угла между оптическими осями.

По необходимым компенсаторам и поляризаторам Вы можете получить бесплатную консультацию у наших специалистов.


Тёмное поле, используемое биологами

Недорогой и эффективный способ выявления оптически активных объектов. Основан на освещении образца полым конусом света, не отражающимся в объектив. Наблюдатель видит только рассеянное от образца картинку. Таким образом можно заметить прозрачные объекты. Одной из разновидностей методик применяющей такое контрастирование, является ультрамикроскопия, при которой препарат освещается мощным потоком фотонов сбоку. Главное преимущества этого освещения: выявление частиц, размером меньше длины волны видимого спектра. Биологи, в частности ветеринары, применяют его для диагностики лептоспироза.


Рисунок 4. Treponema pallidum в тёмном поле

 

Фазовый контраст – нестареющая классика

С момента своего появления, самый распространённый метод контрастирования среди биологов. Бактериологи без окраски видят контуры прокариотов, работники санитарных экспертиз легко находят и диагностируют простейших, в КДЛ давно используют PH для оценки качества спермы. Тысяча применений, но настройкой этого контраста хотят заниматься не многие, и для них Olympus сделал прецентрированный фазовый контраст, реализованный в CKX53.

 

Инфракрасная микроскопия (ИК)

Перспективна для гематологических исследований. Сейчас тестируются ИК определение заболеваний кишечника, содержание многих метаболитов, образованных патологическими изменениями в организме, определение ангины по капле сыворотки крови пациента. Это один из спектрометрических методов исследований основанный на оценке соотношения поглощения-испускания-рассеяния инфракрасного спектра веществами. На макроуровне, с применением MVX10 или SZX16, можно оценивать особенности формирования семян, содержания различных веществ в тканях растений без необходимости их химического анализа.


Как сейчас выбрать биологический лабораторный микроскоп

Сначала определите какой штатив Вам подходит больше. Если Вы будете просматривать объекты прямо в лабораторной посуде (чашках Петри, планшетах, колбах, флаконах), то приобретайте инвертированные микроскопы, если же Вам необходимо большое увеличение и контроль морфологии мелких биологических структур, то выбирайте прямой микроскоп. Обозначьте необходимые методы исследований: дифференциальное окрашивание, ДИК, поляризация (простая или количественная, ортоскопия или коноскопия), dark field (нужна ли ультрамикроскопия с кардиоидным конденсором, либо достаточно NA=0,6). Подберите подходящую оптику, которая должна соответствовать не только предполагаемому контрастированию, но и качеству изображения, которым Вы будете довольны. Приведём классификацию ниже:

Монохроматы – объективы, с исправленными аберрациями для одной длины волны или очень узкой спектральной области, исправлены сферические искажения, кома и астигматизм. Ахроматы исправлены по двум длин волн (узких спектральных диапазонов), скорректированы по: сферические искажения, коме, астигматизму, хроматичезмы положения и, частично, сферохроматические ошибки. Предназначены для работы в спектральной области от линии F (λ=486нм) до C (λ=656нм). У апохроматов коррекция расширена и распространяется на три длины волны, исправлены: вторичный спектр и сферохроматические отклонения, благодаря наличию особых линз и кристаллов с особым ходом частных относительных дисперсий. Распространены половинные решения, такие как полуапохроматы, полуахроматы, которые могут называться иначе: планфлуориты, план С.

Качественно оценивают получаемую картину по волновым аберрациям. У ахроматов для точки на оси волновые отклонения основного цвета, как правило не превышает 0,25λ, а для всей спектральной области, на которую они рассчитаны, не более 0,5λ. Сферическое искажение в апохроматических объективах не превышает 0,1-0,15λ. Для спектральных линий C и F – не более 0,25λ. У самых высоко апертурных объективов (NA>0,95), по краям величины могут быть выше 0,5λ, из-за отклонений высшего порядка, но образ всё равно контрастное и качественное.

План делятся на планахроматы (PLN), планполуапохроматы (UPLFLN) и планапохроматы (PLAPON). они аналогичны соответствующим ахроматами и прочим, но в них существенно лучше исправлены кривизна поверхности и астигматизм, а волновые аберрации в пределах всего поля не превышают 0,5λ.

Выбор конденсора очень важен для биологического микроскопа, потому что от этого также зависит разрешающая способность всего микроскопа

Конденсоры, как и остальная оптика, подразделяются по степени коррекции аберраций, рабочему расстоянию, числовой апертуре и дополнительным вставкам для контраста. Это очень важный модуль микроскопа, от этого зависит равномерность освещения образца. Этот компонент недооценивается многими потому, что в школьных микроскопах на уроках биологии он отсутствует, есть лишь зеркало и отверстие в столике, но для себя, необходимо сравнить картины, получаемое без конденсора, и с ним. Дело в том, что некогерентный и ненаправленный свет от лампы, распространяется во всех направлениях, частично отражаясь и рассеиваясь, а значит на предметное стекло, попадает, не более 15-20%. Именно электромагнитные волны формируют картинку, и от их количества зависит разрешающая способность всей системы. Апертура – это угол, под которым линза собирает или испускает лучи, если у конденсора она выше, чем у объектива, то лучи, проходящие мимо детектора просто засоряют рисунок. Когда происходит обратное, у чечевиц NA выше, они не раскроют весь свой потенциал.

Заключение

Значимость микроскопии в биологических лабораториях трудно переоценить. Основные направления развития: новые способы контрастирования, селективные флюорофоры, спектрометрические методы, линзы сверхвысокого разрешения, съёмка на камеры с высокими выдержкой или фреймрейтом. Вплотную к оптическому пределу подошли конфокальные системы, а атомно-силовые микроскопы (АСМ) даже преодолели его.

По вопросам консультации и поставки — свяжитесь с нами любым удобным способом:

+7 (495) 234-23-32 

[email protected]

Форма обратной связи


Фильтры для микроскопов и их применение

Фильтры для микроскопов используются как для наблюдения, так и для фотомикроскопии. Каждый фильтр микроскопа используется для разных целей, и все они обычно размещаются на пути света, либо над осветителем, либо в прорези для фильтра, которая находится на пути света. Некоторые фильтры микроскопа помещаются в прорезь для фильтра в корпусе осветителя, если используется внешний осветитель. Ниже вы найдете общие фильтры для микроскопов и их предполагаемое использование.Здесь можно купить все фильтры для микроскопов.

Зеленый интерференционный фильтр : Объективы микроскопов Ахромат и Планахромат лучше всего сферически корректируются для зеленого света. Это означает, что их производительность улучшается при использовании зеленого фильтра. Фазоконтрастные объективы также созданы для получения наилучшего фазового изображения в зеленом свете.

Фильтр синего дневного света : Фильтр синего дневного света для микроскопа предназначен только для наблюдения. Он обеспечивает бледный серо-голубой оттенок в поле зрения и часто используется для балансировки света, создаваемого вольфрамовыми или галогенными лампами микроскопа, чтобы сбалансировать цвет света микроскопа.Фильтр дневного синего цвета не предназначен для использования с микрофотографией с пленкой дневного цвета. Для цветной пленки дневного света требуется фильтр преобразования синего цвета, который повысит цветовую температуру источника света и имитирует свет дневного света с качеством цветовой температуры, необходимым для цветной пленки со сбалансированным дневным светом.

Фильтр матового стекла : Этот фильтр микроскопа часто помещают над осветителем, чтобы получить более равномерный и рассеянный свет. Фильтры из матового стекла для микроскопов часто используются с вольфрамовым источником света.

Фильтр нейтральной плотности (ND) : Фильтр микроскопа нейтральной плотности используется для уменьшения света на процент. На фильтрах ND указаны разные номера, например ND8 или ND50. ND50 означает, что свет уменьшен на пятьдесят процентов. Фильтры нейтральной плотности часто используются в микрофотографии.

Дидимиевый фильтр : Этот микроскопический фильтр известен как усиливающий фильтр. Дидимиевый фильтр изготовлен из дидимиевого стекла для увеличения интенсивности и насыщенности красных объектов.Поскольку тонкие срезы биологической ткани часто окрашивают одним или несколькими красителями для улучшения видимости особенностей образца, при фотографировании этих образцов желательно, чтобы окрашенные цвета отображались на фотографии. Хотя большинство пятен хорошо видны на цветной пленке, некоторые из них выглядят размытыми. Дидимиевые фильтры помогают бороться с этой размытой проблемой.

Желтый фильтр : Желтый фильтр микроскопа обычно используется для точной настройки цветового баланса вольфрамовых и галогенных источников света микроскопа для микрофотографии с цветной пленкой.Кроме того, есть несколько применений в металлургических микроскопах, где желтый фильтр помогает обнаруживать повреждения в металлических конструкциях.

Фильтры

Введение

Световой микроскоп остается одним из наиболее часто используемых инструментов для исследований, особенно в областях биологических или биофизических наук, и предлагает средства для наблюдения за динамикой клеточных процессов. Важным компонентом этих методов является получение наилучшего возможного представления образца , в то же время минимизируя повреждение образца, артефакты, и неопределенность .

Свет состоит из непрерывного спектра многих длин волн, представляющих различных цветов . Часто включение несоответствующего широкого диапазона длин волн света во время экспериментов по визуализации может привести к различным проблемам, таким как артефакты, перекрестные помехи, просачивание, повреждение / фототоксичность образца и низкий контраст изображения, но слишком узкий диапазон может привести к низкой интенсивности сигнала.

Чтобы предотвратить это, важно, чтобы выборочно отфильтровывал определенные длины волн света. и пропускали другие , чтобы повысить качество получаемого изображения, а также минимизировать нежелательное повреждение образца.Без фильтров детектор не смог бы отличить флуоресцентное излучение от возбуждающего света и автофлуоресценцию в образце. Следовательно, определение того, какие фильтры необходимы и как они должны быть настроены и введены в световой путь, является важным компонентом получения высококачественных изображений.

В этой статье будут представлены и подробно обсуждены различные фильтры, чтобы проинформировать пользователей микроскопов о типах доступных фильтров и о том, как правильно определить нужный им фильтр.

Зачем нужны фильтры в микроскопии?

Фильтры для микроскопии изменяют свет в оптической системе визуализации. Это может быть для целей наблюдения или для получения высококачественных изображений с помощью детектора.

Каждый фильтр для микроскопии может служить для различных целей , и фильтры можно использовать для различных улучшений, таких как:

  1. Повышение контрастности
  2. Блокировка окружающего света
  3. Удаление вредных УФ- или ИК-лучей
  4. Выборочное пропускание или пропускание определенных длин волн света (например, возбуждающего света)
  5. Исправление проблем с оптическим трактом
  6. Уменьшение интенсивности света.

Фильтры вставляются в световой путь в различных точках в зависимости от их функции . Одним из наиболее распространенных применений фильтров в приложениях флуоресцентной визуализации является разделение различных длин волн света для селективного возбуждения определенных флуорофоров и последующее разделение испускаемого и возбуждающего света для получения высококонтрастных изображений. В правильно сконфигурированном микроскопе только испускаемый свет должен достигать детектора, так что получаемые флуоресцентные структуры имеют высокий контраст на очень темном или черном фоне.Для этого необходима правильная фильтрация.

Фильтрующие механизмы

Фильтры — это оптических компонентов , которые пропускают определенные длины волн света, ослабляя или блокируя другие. Уровень затухания фильтров описывается оптической плотностью из-за множества различных методов, доступных для блокировки света. Различные используемые методы зависят от типа фильтра, из которых существует три основных типа: поглощающий , помеховой и акустический .

Поглощение

Фильтры на основе абсорбции обычно состоят из цветного стекла , которое избирательно поглощает длины волн света и преобразует энергию в тепло.

Это относительно недорогих , стабильных и долгоживущих при нормальных условиях. Эти фильтры обычно изготавливаются из цветного стекла или желатина, помещенного между двумя стеклянными пластинами. Тем не менее, они обычно ограничены небольшим набором цветов , они предлагают низкий пиковый коэффициент пропускания и небольшую гибкость в доступной толщине.Процесс поглощения также преобразует лучистую энергию в тепла , что может привести к растрескиванию стекла при интенсивном освещении.

Помехи

Фильтры на основе помех состоят из нескольких тщательно разработанных слоев , которые избирательно передают длины волн на основе эффектов интерференции, возникающих между падающей и отраженной волнами на границах слоев.

Большинство оптических фильтров представляют собой интерференционные фильтры , которые основаны на принципе интерферометра Фабри-Перо (или эталона ).Эти многослойные устройства состоят из микроскопически тонких слоев материала, состоящего из различных типов стекла или плавленого кварца, каждое из которых имеет две отражающие поверхности или зеркала. Пиковая длина волны передачи соответствует резонансу эталона ( Рис.1 ). Включено несколько эталонных слоев с разной длиной оптического пути для передачи более широкого диапазона длин волн, а ширина полосы фильтра определяется количеством этих слоев. Использование интерференционных фильтров в микроскопии значительно расширилось из-за высокого уровня селективности и пропускания по сравнению со стеклянными аналогами.

Рисунок 1: Принцип действия интерференционных фильтров (на основе эталона). Свет входит в эталон (черный) и проходит через множество отражений / преломлений / пропускания в зависимости от цвета (синий и красный), интерференция света, выходящего из эталона во время каждого отражения, вызывает модуляцию в проходящем и отраженном лучах.
Акустический

Акустические фильтры состоят из двулучепреломляющего кристалла ; применение колеблющейся радиочастоты (RF) изменяет показатель преломления и, следовательно, дифракционные свойства кристалла.Изменение RF изменяет длину волны дифрагированного света, что позволяет быстро настраивать длину волны .

Акустические фильтры, также известные как акустооптические перестраиваемые фильтры (AOTF). все чаще включаются в приложения микроскопии, поскольку они не страдают механическими ограничениями, ограничениями по скорости и могут легко адаптироваться к большому количеству различных лазерных систем и выходных длин волн. Обычно они ограничиваются хорошо сколлимированными источниками света.Для AOTF существует несколько ограничений, в том числе их неспособность работать с длинами волн менее 450 нм и , а также то, что тепловые эффекты могут изменять показатель преломления кристалла до тех пор, пока не будет достигнута стабильность.

Типы фильтров

Три наиболее распространенных типа фильтров, используемых для выбора цвета во флуоресцентной микроскопии: фильтры возбуждения , барьерные фильтры и дихроичные светоделители . В современных микроскопах это обычно интерференционные фильтры.

  1. Фильтры возбуждения позволяют пропускать свет определенных длин волн (длины волн возбуждения) на пути к образцу.
  2. Барьерные / эмиссионные фильтры ослабляют длины волн возбуждения и пропускают только выбранные длины волн эмиссии в направлении глаза или детектора.
  3. Дихроичные зеркала — это специализированные фильтры, которые состоят из тонкого куска материала с покрытием (часто кварцевого стекла УФ-класса), установленного под углом 45 °.Этот материал с покрытием разработан, чтобы эффективно отражать длины волн возбуждения и передавать длины волн излучения с эффективностью до 95%.

Фильтры обычно могут пропускать только коротких волн , длинных волн или полосу между длинными и короткими волнами, и они называются и определяются следующим образом:

  1. Длинный проход (LP) фильтры пропускают длины волн, превышающие определенную длину волны, описываемую длиной волны при 50% пикового пропускания.
  2. Короткопроходные (SP) фильтры пропускают длины волн ниже определенной длины волны
  3. Полосовые фильтры (BP) пропускают световые длины волн между двумя разными длинами волн, давая полосу передаваемых длин волн.

Фильтры LP, SP и BP описаны далее в Рис. 2 .

Рисунок 2: Графики изменения коэффициента пропускания в зависимости от длины волны для фильтров SP, LP и BP. Проходящий свет отображается яркими цветами, а ослабленный свет — тусклым.Для SP-фильтра передаются более короткие длины волн, в то время как свет с более длинными волнами блокируется, и наоборот, для LP-фильтров. В фильтрах BP комбинация характеристик фильтра SP и LP передает только полосу длин волн света, такую ​​как зеленый свет в этом примере. Наклон фильтра — это градиент кривой между переданной и заблокированной длинами волн. Это заставляет SP передавать синий / зеленый, LP передавать желтый / красный, а BP передавать любой диапазон, но обычно зеленый.

Хотя исторически использовались фильтры SP и LP, большинство современных фильтров являются фильтрами BP из-за дополнительного контроля длины волны.Большинство флуорофоров в флуоресцентной микроскопии имеют очень четко определенные полосы профилей возбуждения и испускания, поэтому фильтры BP очень хорошо работают для избирательного пропускания возбуждающего света и испускаемого света для улучшения генерации и сбора сигналов.

Наборы фильтров

Обычная проблема с фильтрами — это знать, как ориентировать их на световом пути. Для упрощения и простоты использования фильтры обычно согласованы и объединены для создания куба фильтра ( рис.3 ). Кубики фильтров , таким образом, состоят из фильтра возбуждения , дихроичного фильтра и барьерного фильтра , правильно ориентированных для обеспечения флуоресцентной визуализации определенных длин волн света, при одновременном удалении любых помех или артефактов от других источников, таких как как свет возбуждения.

Наборы оптических фильтров , которые используются для регистрации флуоресценции, разработаны для основных длин волн, используемых в приложениях флуоресценции, которые основаны на наиболее часто используемых флуорофорах .По этой причине кубы часто называют в честь флуорофора, для визуализации которого они предназначены, например, DAPI (синий), FITC (зеленый) или TRITC (красный) кубики фильтра. Эти кубики фильтров помещаются на световом пути и избирательно фильтруют свет, чтобы обеспечить высококонтрастное флуоресцентное изображение. Фильтры внутри фильтрующих кубиков разных производителей чаще всего не взаимозаменяемы.

Рисунок 3: Пример куба фильтра и то, как свет взаимодействует с различными компонентами.Белый свет попадает в куб фильтра на фильтре возбуждения (синий), который избирательно пропускает длины волн, необходимые для возбуждения интересующего флуорофора. Затем прошедший свет взаимодействует с дихроичным (желтым) светом, где он с высокой эффективностью отражается в сторону образца. Флуорофоры возбуждаются и излучают характерную длину волны, которая длиннее, чем у возбуждающего света, и вместе с отраженным возбуждающим светом возвращается обратно в фильтрующий куб. Теперь дихроичный свет отражает обратно рассеянный свет от детектора, в то время как пропускает более длинноволновый эмиссионный свет.Затем свет снова фильтруется эмиссионным фильтром (красным) перед обнаружением.

Во время флуоресцентного сбора данных, свет с определенной длиной волны генерируется путем прохождения мультиспектрального света от источника света через фильтр возбуждения, выборочно пропуская желаемые длины волн возбуждения. Длины волн, которые проходят через фильтр возбуждения, затем отражаются от поверхности дихроичного зеркала, которое наклонено под углом 45 ° к свету возбуждения, через линзу объектива к образцу, возбуждая флуорофоры, спектр возбуждения которых коррелирует с длиной волны свет.

После возбуждения флуорофоры излучают свет с большей длиной волны по сравнению со светом возбуждения, этот свет излучения собирается линзой объектива и возвращается обратно к дихроичному зеркалу, где он может проходить (из-за большей длины волны). Нежелательный рассеянный возбуждающий свет отражается к источнику света. Излучаемый свет перед попаданием в детектор затем фильтруется эмиссионным фильтром, который удаляет любой остаточный нежелательный свет (например, автофлуоресценцию).

Эти высокоэффективные наборы фильтров обеспечивают максимальное ослабление возбуждающего света на пути обнаружения параллельно с успешным захватом как можно большего количества излучаемых фотонов. Высокая эффективность обнаружения позволяет соответствующим образом снизить уровень освещенности и, таким образом, снизить фототоксичность для образца.

Пример спектральной диаграммы куба фильтра Alexa Fluor 488 показан на рис. 4 . Показаны спектры возбуждения и испускания Alexa Fluor 488, а также показаны соответствующие фильтры возбуждения, испускания и дихроичные фильтры, специально подобранные для визуализации этого флуорофора.

Рисунок 4: Спектральная диаграмма возбуждающих, дихроичных и эмиссионных фильтров в фильтрующем кубе, предназначенном для изображения красителя Alexa Fluor 488. График, показывающий спектры возбуждения (зеленая черта) и эмиссии (зеленый) Alexa Fluor 488. Длины волн пропускания показаны полосовой фильтр возбуждения (синий), дихроичный (оранжевый) и полосовой фильтр излучения (зеленый). Адаптировано из Spectraviewer ThermoFisher.

Помимо индивидуальных наборов фильтров , доступны также двухканальных и трехполосных фильтров , которые позволяют одновременно получать изображения с нескольких флуорофоров.Например, комбинации фильтров DAPI-FITC-TRITC позволяют одновременно обнаруживать те или иные флуорофоры со схожими спектральными характеристиками. Однако необходимо следить за тем, чтобы возбуждение любого включенного флуорофора как можно меньше перекрывалось с диапазоном длин волн передаваемого излучения другого — это привело бы к так называемой «перекрестной помехе », когда возбуждающий свет непреднамеренно достигает детектора.

Именование фильтров

Существует множество необычных условных обозначений для имен фильтров, которые могут сбивать с толку.Точно так же многие производители применяют свою собственную номенклатуру. Как уже упоминалось, тремя основными классами являются фильтров возбуждения , фильтров излучения / барьера и дихроичных фильтров , но фильтры также можно разделить на категории SP, LP или BP. Обычно фильтры обозначаются этими характеристиками и длиной волны , где они переключаются между передачей и отражением .

Идентификационные данные различных типов фильтров и их номенклатура следующие:

  1. Фильтры возбуждения : можно использовать Ex или X .Фильтры возбуждения включают синее стекло (BG) или ультрафиолетовое стекло (UG)
  2. Эмиссионные / барьерные фильтры : можно использовать BA или M . Эмиссионные / барьерные фильтры включают желтое стекло ( Y или GG ) или красное стекло ( R или RG ).
  3. Фильтры Dichroic : также могут называться светоделитель (BS), хроматические светоделители (CBS), дихроичное зеркало (DM), teiler kante ( TK , немецкий язык для разделителя кромок), farb teiler ( FB , немецкий для цветоделителя) или коэффициент отражения, короткий проход ( RKP )

Кроме того, чтобы различать короткие, длинные и полосовые фильтры, фильтры имеют обозначение SP (или KP из канте. , немецкое слово для edge ), LP (или L ) и BP (или B ) соответственно.

Часто имена фильтров включают чисел тоже. Как наиболее распространенная единица для описания фильтров с длиной волны нм в нм, она используется для описания свойств фильтров. Для фильтра BP используется центральная длина волны ( CWL ) при 50% пикового пропускания, за которой часто следует полоса пропускания. Для LP-фильтра используемое число будет длиной волны «среза». Для SP-фильтра это будет длина волны «отсечки», то есть точка, в которой фильтр переключается с передачи на отражение и передает 50% пиковой передачи.

Чтобы дать пример этого: гипотетический фильтр BP представляет собой комбинацию короткого прохода ( 550 нм ) и длинного прохода ( 500 нм ), который по отдельности будет обозначен как SP550 и LP500 , но при описании комбинация фильтров BP, она будет обозначена как BP 525d25 . Это указывает на полосу пропускания с центром на 525 нм с разрешенной передачей 25 нм с любой стороны.

Другие типы фильтров

Существуют и другие типы фильтров для микроскопии.В следующем списке указаны их названия и способы использования:

  1. Фильтры нейтральной плотности (ND) : используются для уменьшения интенсивности освещающего света в широком спектре без изменения диапазона доступных длин волн. Они имеют постоянное затухание в диапазоне видимых длин волн и, таким образом, снижают интенсивность света за счет отражения или поглощения. Фильтры ND доступны в различных плотностях и материалах, и их можно складывать в стопку для увеличения оптической плотности и значительного ослабления интенсивности света.
  2. Клиновые фильтры : толщина изменяется непрерывно или ступенчато через фильтр в форме клина. Они также известны как линейно-регулируемые фильтры (LVF) . Он используется для таких приложений, как гиперспектральные датчики .
  3. Поляризационные фильтры : поляризация света линейная или круговая. Это может быть использовано для микроскопии в поляризованном свете , который является методом без меток для исследования двулучепреломляющих (двойное преломление) анизотропных материалов.
  4. Инфракрасные (инфракрасные или тепловые) фильтры : выборочно блокируют или пропускают инфракрасный свет. Многие ИК-фильтры используются для предотвращения нежелательного нагрева из-за ИК-излучения. Дома с осветительными лампами часто содержат фильтр подавления инфракрасного света. Визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR) эффективна, потому что пропускание тканей выше на более длинных волнах, что идеально для таких приложений, как визуализация мелких животных. Для этого типа изображения доступны наборы NIR-фильтров.
  5. Ультрафиолетовые (УФ) фильтры : избирательно блокируют или пропускают УФ-свет.Создание фильтров для УФ-области электромагнитного спектра является сложной задачей, но новые покрытия с использованием технологии ионно-лучевого распыления с использованием недавно разработанных покрытий теперь предлагают фильтры для диапазона 250–320 нм.
  6. Дидимиевые фильтры : изготовлены из стекла дидимия для увеличения интенсивности и насыщенности красных объектов . Это помогает предотвратить проблему вымывания, вызываемую некоторыми цветными пятнами. Их часто используют с гистопатологическим окрашиванием для усиления красителей, таких как эозин , фуксин, и метиленовый синий .
  7. Желтые фильтры : точная настройка цветового баланса вольфрамовых и галогенных источников света микроскопа для цветной микрофотографии . Желтый фильтр также может быть полезен для металлургической микроскопии для выявления дефектов в металлических конструкциях.
  8. Матовые стеклянные фильтры : помещаются над осветителем для получения более равномерного и рассеянного света. Они часто используются с вольфрамовыми источниками света .

Сводка

Современный микроскоп является центральным инструментом в научных исследованиях, и много усилий направлено на максимальное использование информации, полученной в результате микроскопических экспериментов. Важнейшей частью микроскопии является обеспечение того, чтобы образец получал правильный освещающий свет, чтобы гарантировать эффективное возбуждение флуорофора и испускание наибольшего количества фотонов. Не только это, но и обеспечение того, чтобы как можно больше этих фотографий было снято с максимальной эффективностью, одновременно удаляя нежелательный свет и минимизируя экспозицию образца, тем самым ограничивая разрушение флуорофора.

Фильтры обеспечивают средства эффективной фильтрации света, проходящего через систему, в основном в виде кубиков флуоресцентных фильтров . Эти кубики специально разработаны для одного или нескольких интересующих флуорофоров и являются важным компонентом высококачественной флуоресцентной визуализации. Обеспечение правильных комбинаций фильтров, включенных в систему (и в правильном месте ) может максимизировать качество изображения и минимизировать повреждение образца .Аналогичным образом, другие типы фильтров часто включаются в микроскопы в зависимости от конкретных индивидуальных потребностей. Сюда могут входить светоделители, позволяющие получать изображения одновременно с несколькими длинами волн, поляризационные фильтры, разрешающие микроскопию в поляризованном свете, нейтральные фильтры, снижающие интенсивность многоспектрального света, фильтры для удаления вредных инфракрасных или УФ-лучей, а также другие фильтры, используемые для повышения качества изображения, такие как дидимиевые фильтры. и желтые фильтры.

Флуоресцентные источники света: сравнительное руководство

Интенсивность и спектр света

Источник света, используемый в экспериментах по флуоресцентной микроскопии, должен излучать свет определенной длины волны, который возбуждает флуорофоры, присутствующие в образце.Этот свет должен излучаться с достаточно высокой интенсивностью, чтобы стимулировать как можно больше флуоресцентного излучения. Для получения дополнительной информации о том, как работает этот метод, прочтите наш обзор широкопольной флуоресцентной микроскопии.

Часто используются источники белого света, поскольку белый свет содержит все длины волн видимого спектра с равной интенсивностью. Это означает, что определенные длины волн в этом диапазоне могут быть выбраны с помощью фильтров возбуждения.

Рисунок 2: Электромагнитный спектр включает в себя длины волн УФ, видимого и инфракрасного излучения, которые излучаются различными источниками света, используемыми в широкопольной флуоресцентной микроскопии.Изображение предоставлено: Wikimedia Commons

Фильтры возбуждения выбирают конкретную требуемую длину волны, но, поскольку они не подавляют весь периферийный свет, источник света должен иметь высокую интенсивность в спектрах возбуждения флуорофора. Это предотвращает нежелательное возбуждение других флуорофоров в образце, а также повреждение образца светом.

Требуемая интенсивность света может зависеть от образца, который вы визуализируете. При визуализации живых клеток лучше всего использовать более низкую интенсивность возбуждающего света, чтобы избежать повреждения клетки из-за фотообесцвечивания и фототоксичности.Принимая во внимание, что для освещения больших полей зрения или когда требуется высокая скорость для визуализации изменений в образце, требуются источники света более высокой интенсивности.

Дуговые лампы

Ртутные и ксеноновые дуговые лампы — это источники белого света, излучающие широкий диапазон длин волн от ультрафиолетового (УФ) до инфракрасного (ИК). Они имеют много интенсивных полос на длинах волн в УФ и видимом спектре света и излучают яркий УФ-свет. Поскольку они покрывают весь видимый спектр, если используется новый краситель, фильтрующий куб может фильтровать новую длину волны возбуждающего света с использованием той же лампы.

Однако дуговые лампы не обеспечивают равномерной освещенности в видимом спектре света; основные пики находятся в ближней УФ-области спектра, а два других — в зеленой / желтой части спектра. Пики находятся на длинах волн 313, 334, 365, 405, 436, 546 и 579 нм, оставляя зазоры в областях, которые возбуждают многие важные флуорофоры, такие как флуоресцеин и флуо-4.

Рисунок 3: Спектры возбуждения и испускания флуоресцеина; пиковая длина волны возбуждения составляет 494 нм, что не является максимальной длиной волны, излучаемой дуговыми лампами.

Ксеноновые дуговые лампы имеют более стабильную интенсивность во всем спектре по сравнению с ртутными. Эта интенсивность выше в инфракрасном диапазоне, что означает выделение большого количества избыточного тепла, которое может повредить живые образцы.

Поскольку дуговые лампы излучают свет высокой интенсивности, фиксированные образцы могут страдать от фотообесцвечивания, если не используются фильтры нейтральной плотности для уменьшения интенсивности света или если не уменьшается время экспонирования.

В отличие от светодиодов, в дуговых или вольфрамово-галогенных лампах нельзя точно регулировать интенсивность света.Это связано с тем, что интенсивность регулируется с помощью фильтров нейтральной плотности или ирисовой диафрагмы. Они имеют ограниченный контроль интенсивности, поскольку они позволяют использовать несколько дискретных полос интенсивности, а не позволяют изменять интенсивность меньшими приращениями.

Вольфрамово-галогенные лампы

Спектр вольфрамово-галогенных ламп аналогичен дуговым лампам, с меньшей пиковой интенсивностью и более равномерным освещением по всему полю зрения. Вольфрамово-галогенные лампы предварительно настраиваются, что позволяет сэкономить время и силы.

Когда один микроскоп будет использоваться для разных экспериментов, наиболее подходящими являются источники света, которые могут излучать большой диапазон длин волн. Вольфрамово-галогенные лампы лучше всего подходят для этих целей, поскольку они могут обеспечивать длины волн в видимом диапазоне света с достаточно высокой мощностью, чтобы возбуждать флуорофоры. Однако эти лампы имеют слабое излучение в ультрафиолетовой части спектра, поэтому дуговые лампы больше подходят для визуализации образцов, требующих длины волны ниже 400 нм.

Вольфрамово-галогенные лампы выделяют много избыточного тепла.Это может привести к более быстрому разложению образца, поэтому для предотвращения этого необходим теплоизоляционный фильтр.

Светодиоды

Светодиоды

— это твердотельные полупроводниковые устройства, которые излучают свет напрямую, без использования лампочки. Светодиоды могут излучать свет в диапазоне видимого света с дискретными узкими пиками возбуждения. Яркость светодиодов можно точно регулировать с шагом 1%. Интенсивность может быть больше, чем у ртутных ламп в синей и красной областях возбуждения, но слабее, чем у ртутных ламп в зеленой области возбуждения.Светодиоды излучают свет меньшей интенсивности на длинах волн в УФ-части спектра. Самая низкая длина волны излучаемого света составляет 340 нм, поэтому некоторые УФ-красители не могут быть возбуждены светодиодами.

Светодиоды

обеспечивают быстрое переключение между длинами волн, что означает, что несколько флуорофоров могут быть возбуждены в одном образце в течение одного эксперимента. Они особенно подходят для быстрого получения многоцветных изображений.

Краткое руководство по световой микроскопии в клеточной биологии

Mol Biol Cell. 2016 15 января; 27 (2): 219–222.

Дуг Келлог, редактор мониторинга

Калифорнийский университет, Санта-Крус

Кафедра биохимии и биофизики Калифорнийского университета, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Калифорния 94158

Получено 25 августа 2015 г .; Пересмотрено 30 сентября 2015 г .; Принято 6 октября 2015 г.

Авторские права © Thorn, 2016 г. Эта статья распространяется Американским обществом клеточной биологии по лицензии авторов. Через два месяца после публикации он становится общедоступным под условным обозначением «Attribution-Noncommercial-Share Alike 3».0 Непортированная лицензия Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0).

«ASCB®», «Американское общество клеточной биологии®» и «Молекулярная биология клетки®» являются зарегистрированными товарными знаками Американского общества клеточной биологии.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Световая микроскопия — ключевой инструмент современной клеточной биологии. У световой микроскопии есть несколько функций, которые делают ее идеально подходящей для визуализации биологии в живых клетках: разрешение хорошо согласовано с размерами субклеточных структур, широкий спектр доступных флуоресцентных зондов позволяет маркировать белки, органеллы и другие структуры для визуализация и относительно невозмущающий характер света означает, что живые клетки могут быть визуализированы в течение длительных периодов времени, чтобы следить за их динамикой.Здесь я даю краткое введение в использование световой микроскопии в клеточной биологии, уделяя особое внимание факторам, которые следует учитывать при запуске микроскопических экспериментов.

ВВЕДЕНИЕ

В широком смысле методы световой микроскопии можно разделить на две категории: светлое поле и флуоресценция. В светлопольной микроскопии источник света и детекторный объектив размещаются на противоположных сторонах образца, и образец визуализируется по его влиянию на проходящий через него свет, когда образец поглощает, рассеивает или отклоняет свет.Поскольку большинство клеток тонкие и прозрачные, они не поглощают много света и поэтому их трудно увидеть без добавления оптики, которая позволяет видеть фазовый сдвиг света, индуцированный клетками. Два наиболее часто используемых метода визуализации этого фазового сдвига — это фазовый контраст, который заставляет клетки казаться темными на светлом фоне, и дифференциальный интерференционный контраст (DIC), который дает псевдотрехмерный (3D) оттенок для клеток ( Мерфи и Дэвидсон, 2012). Яркого поля без фазового контраста или ДИК обычно достаточно, чтобы увидеть общие очертания ячеек, но фазовый контраст или ДИК необходимы для получения подробных высококонтрастных изображений светлого поля.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

В флуоресцентной микроскопии используются флуоресцентные красители (флуорофоры), которые представляют собой молекулы, которые поглощают одну длину волны света (длину волны возбуждения) и излучают вторую, более длинную длину волны (длина волны излучения). Большинство молекул в клетке не очень флуоресцируют, поэтому флуоресцентные метки, которые нужно отобразить, обычно вводит экспериментатор. Это позволяет нацеливать метки на интересующие молекулы либо путем генетического кодирования флуоресцентного белка, либо путем связывания флуоресцентно меченного антитела.Множественные флуоресцентные молекулы могут различаться одновременно и могут быть обнаружены с очень низким содержанием (можно визуализировать отдельные молекулы), что делает этот метод очень мощным. Флуоресцентная микроскопия обычно выполняется с использованием эпифлуоресценции, при которой возбуждающий свет флуоресценции освещает образец через тот же объектив, который используется для обнаружения излучения образца. Куб с флуоресцентным фильтром разделяет свет по длине волны, так что излучаемый свет может быть отображен без помех от возбуждающего света (Мерфи и Дэвидсон, 2012).

Двумя основными методами введения флуоресцентных меток в клетки являются иммунофлуоресценция, при которой вводятся флуоресцентно меченые антитела, которые связываются со специфическими белками в клетках, и генетическое введение флуоресцентного белка. При иммунофлуоресценции клетки сначала фиксируются для сшивания белков в клетке, а затем пермеабилизируются, чтобы позволить антителам проникнуть в клеточную среду. Обычно сначала вводятся первичные антитела, которые распознают интересующие белки в клетке.После смывания несвязавшихся антител добавляются вторичные антитела, меченные флуоресцентной меткой, которые связываются с первичными антителами. Это называется непрямой иммунофлуоресценцией и позволяет легко переключать первичные антитела, поскольку они не нуждаются в метке, а вторичные антитела обычно имеют широкую специфичность (например, вторичный козий антимышиный вторичный, который распознает все мышиные иммуноглобулины G).

Генетическое введение флуоресцентного белка включает слияние флуоресцентного белка с интересующей мишенью, которая затем либо вводится в геном клетки, либо экспрессируется из плазмиды.Это позволяет визуализировать белки в живых клетках и, если это делается путем геномного введения, означает, что белок экспрессируется из своего эндогенного промотора на своем эндогенном уровне. И для иммунофлуоресцентной, и для флуоресцентной визуализации белков легко отобразить четыре цвета в клетке. Чаще всего используются наборы фильтров с длинами волн возбуждения 405, 488, 561 и 640 нм. Для иммунофлуоресценции типичными красителями являются ядерный краситель 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол, зеленые красители, такие как Alexa 488 или флуоресцеин, красные красители, такие как Cy3, родамин или Alexa 568, и далеко красные красители, такие как Cy5. или Alexa 647.Для флуоресцентных белков mTagBFP2, усиленный зеленый флуоресцентный белок, mCherry / mRuby2 / TagRFP-T и мономерный инфракрасный флуоресцентный белок могут использоваться вместе. В частности, в канале возбуждения 640 нм быстро разрабатываются новые флуоресцентные белки, и в ближайшем будущем могут появиться лучшие комбинации; обзоры флуоресцентных белков см. в Day and Davidson (2009) и Dean and Palmer (2014).

ШИРОКАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И РАЗРЕШЕНИЕ

Большинство изображений клеточной биологии выполняется с помощью широкопольной микроскопии, при которой микроскоп просто формирует изображение образца на камере без каких-либо дополнительных оптических манипуляций.Живые клетки чаще всего визуализируются на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе (). В таком микроскопе объектив изображает образец снизу. Инвертированные микроскопы популярны для получения изображений биологических клеток, поскольку они позволяют получать изображения через покровное стекло, чтобы увидеть клетки, выросшие выше. Это означает, что клетки можно выращивать в чашках Петри с нижним покровным стеклом или в многолуночных планшетах, содержащих питательную среду, которую можно оставить открытыми сверху. В качестве альтернативы можно использовать вертикальный микроскоп с объективом, погружаемым в воду, который погружают в среду, в которой растут клетки, но это менее удобно и менее распространено.

Схематические изображения общих методов микроскопии. (А) Инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп. Образец находится между предметным стеклом и покровным стеклом. Конденсорная линза обеспечивает освещение для просмотра света, проходящего через образец; линза объектива собирает свет от образца и доставляет возбуждающий свет для флуоресцентной микроскопии. Куб фильтра состоит из фильтра возбуждения (синий), эмиссионного фильтра (зеленый) и дихроичного зеркала (серый). Фильтры возбуждения и излучения выбирают длины волн, которые будут освещать образец и записываться на камеру, соответственно, а дихроичное зеркало отражает свет возбуждения на образец, передавая свет излучения на камеру.Прямой микроскоп имеет такую ​​же конструкцию, только повернут на 180 °. (B) Конфокальный микроскоп. Точечные отверстия возбуждения и излучения отображаются на образце для определения освещенной точки в образце и для обнаружения света только из этой точки. Линзы, которые отображают точечные отверстия на образце, для простоты опущены. Сканирующее зеркало сканирует освещенное пятно поперек образца; поскольку сканирующее зеркало находится как на пути возбуждения, так и на пути излучения, положение пятна, обнаруженного на образце, сканируется параллельно с пятном возбуждения.(C) Световой микроскоп. Объектив освещения вместе с дополнительной оптикой (не показана) используется для формирования тонкого светового пучка, который освещает образец. Объектив обнаружения отображает свет, излучаемый этим листом, на камеру.

Большинство ключевых свойств микроскопа определяется выбором линзы объектива. Объектив определяет увеличение и разрешение изображения; он также определяет, сколько света будет собираться от образца и, следовательно, чувствительность микроскопа.Объективные характеристики во многом определяются его увеличением и числовой апертурой (NA). Кроме того, объективы делятся на несколько классов в зависимости от того, насколько хорошо были исправлены аберрации; они обозначаются такими терминами, как Ахромат и План Апохромат. Увеличение объектива определяет, насколько большим будет изображение в камере относительно образца; объектив 60 × дает изображение образца на камере, которое в 60 раз больше, чем образец. ЧА определяется как синус наибольшего угла света, излучаемого образцом, который может улавливать объектив, умноженный на показатель преломления образца, для которого предназначен объектив.Это контролирует как светосилу объектива (сбор большего диапазона углов собирает больше света; это масштабируется как квадрат NA), так и предел разрешения объектива. В плоскости XY (плоскость, перпендикулярная оси фокуса) теоретическое разрешение равно 0,61λ / NA, а теоретическое разрешение Z равно 2λ n / NA 2 , где λ — длина волны света, а n — показатель преломления образца.Хотя разрешение объектива задается его числовой апертурой, увеличение объектива важно для обеспечения достаточного увеличения изображения на камере для захвата этого разрешения (правило состоит в том, что на каждый разрешаемый элемент должно быть не менее двух пикселей камеры, чтобы захватить полное разрешение объектива микроскопа; Jonkman et al ., 2003; Inoué, 2006; Murphy and Davidson, 2012). Большинство объективов предназначены для получения изображения через покровное стекло толщиной 0,17 мм.Для получения наилучших изображений важно выращивать клетки на этих покровных стеклах. Если клетки необходимо выращивать на пластике, доступны специализированные объективы для визуализации через пластик, хотя они, как правило, имеют худшие характеристики, чем объективы, предназначенные для визуализации через покровные стекла. В качестве альтернативы можно приобрести специализированную пластиковую посуду с оптическими свойствами, аналогичными покровным стеклам толщиной 0,17 мм.

КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Основным ограничением традиционной эпифлуоресцентной микроскопии является то, что освещающий свет возбуждает флуорофоры в конусе по всему образцу, и камера обнаружения не может отличить этот расфокусированный свет от света, испускаемого фокальной плоскостью образец.Следовательно, сфокусированная информация, которую мы стремимся отобразить, затемняется размытыми изображениями не в фокусе областей образца. Для образцов, которые не слишком толстые и не слишком плотно помечены флуорофором, этот расфокусированный свет не является серьезной проблемой. Однако для толстых, густо окрашенных образцов или в случаях, когда мы хотим получить 3D-изображения с хорошей разрешающей способностью, этот расфокусированный свет может скрыть ценную информацию. Для устранения этого расфокусированного света было разработано множество методов. Чаще всего используется конфокальная микроскопия, при которой образец освещается сфокусированным лазерным лучом в одной точке в фокальной плоскости образца ().Свет из этой точки обнаруживается после прохождения через точечное отверстие, так что только свет, излучаемый из фокальной плоскости, проходит через точечное отверстие и регистрируется детектором. Свет из не в фокусе плоскостей блокируется точечным отверстием, поэтому конфокальная камера регистрирует только свет из фокальной плоскости образца. Сканирующие зеркала используются для растрирования лазерного пятна по образцу, построения изображения точка за точкой (Inoué, 2006; Stelzer, 2006). Связанный с этим метод — двухфотонная микроскопия (Helmchen and Denk, 2005), которая в основном используется для получения изображений очень толстых образцов (> 200 мкм), поэтому в клеточной биологии она обычно не используется.

Поскольку конфокальные микроскопы с лазерным сканированием записывают изображение точка за точкой, они не используют камеры, а используют точечный детектор, который, как правило, менее чувствителен, чем камеры. Чтобы преодолеть это ограничение, были разработаны системы, которые одновременно сканируют несколько фокусных пятен по образцу и отображают результирующее излучение на камере. Наиболее распространенным из них является конфокальный вращающийся диск, в котором используется диск с отверстиями, проходящими по образцу, так что при вращении диска происходит сканирование каждой точки образца во время одной экспозиции (Toomre and Pawley, 2006).Конфокальные микроскопы с вращающимся диском сочетают в себе простоту использования, высокую скорость (до сотен кадров в секунду) и высокую чувствительность, поэтому они широко используются в клеточной биологии. Для образцов толщиной более 30 мкм они хуже отражают расфокусированный свет, чем конфокальные лазерные сканеры, но это не ограничение для визуализации большинства клеток тканевых культур. Конфокальная микроскопия с вращающимся диском считается более благоприятной для живых клеток, чем широкопольная или лазерная конфокальная микроскопия, но окончательных доказательств этого нет.Конфокальная микроскопия с вращающимся диском широко используется для визуализации динамики белков и органелл в отдельных клетках — например, для визуализации наследственности митохондрий у дрожжей (Rafelski et al ., 2012) или для визуализации динамики микротрубочек в клетках млекопитающих (Wittmann and Waterman-Storer, 2005).

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ ПОЛНОГО ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ

Другой метод микроскопии, широко используемый в клеточной биологии, — флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) (Axelrod, 2001).Этот метод основан на полном внутреннем отражении лазерного луча на границе раздела покровного стекла и водного образца над ним. Отраженный лазерный луч создает исчезающее световое поле на границе раздела покровного стекла; кратковременное поле проникает в образец всего на несколько сотен нанометров. Это позволяет возбуждать флуорофоры в пределах нескольких сотен нанометров от покровного стекла, но нигде больше в образце. Это сильно локализованное возбуждение делает микроскопию TIRF одним из самых чувствительных методов микроскопии, поскольку по существу отсутствует фон от остальной части образца, но также ограничивает его использование для визуализации образцов, которые непосредственно примыкают к покровному стеклу.Это сделало TIRF очень мощным методом визуализации динамики мембран и трафика (например, Yudowski et al ., 2009) и коры клеток (например, Hu et al ., 2007), как базальной мембраны клетки. выросшие на покровном стекле, лежат очень близко к покровному стеклу.

СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

Наконец, революция в микроскопии произошла с развитием световых микроскопов (Weber and Huisken, 2011; Keller and Ahrens, 2015). Это микроскопы, которые освещают образец из плоскости, ортогональной плоскости изображения ().Это устраняет проблему расфокусированного света, потому что возбуждается только свет из фокальной плоскости или очень близко к ней. Это избирательное освещение также снижает общую световую экспозицию образца, что, в свою очередь, снижает фотообесцвечивание и фототоксичность. Если для создания светового полотна и обнаружения флуоресценции используются идентичные объективы, их роли можно поменять местами, при этом ортогональные виды образца фиксируются двумя объективами. Затем эти изображения могут быть объединены для создания трехмерного изображения образца с изотропным разрешением, исключая более низкое разрешение Z , чем другие формы микроскопии (Wu et al ., 2013 ). В качестве альтернативы, сложная оптическая конструкция может быть использована для создания микроскопов, которые снимают 3D-изображения с высоким разрешением на высокой скорости (Chen et al ., 2014). Хотя эти микроскопы коммерциализируются, они еще не широко доступны. Я ожидаю, что эти и другие конструкции световых пластин станут широко доступны в ближайшем будущем, ознаменовав революцию в трехмерной микроскопии живых клеток.

МИКРОСКОПИЯ ПРЕВОСХОДНОГО РАЗРЕШЕНИЯ

Еще одна недавняя революция в световой микроскопии — это разработка методов сверхразрешения, которые позволяют разрешение выше, чем у обычной световой микроскопии (Huang et al ., 2010). С помощью этих методов может быть достигнуто разрешение до 20 нм в XY и 50 нм в Z , хотя они часто требуют использования специальных методов подготовки образцов, специальных микроскопов или специальных флуорофоров и могут быть трудными для использования в живые клетки. Хотя микроскопы сверхвысокого разрешения коммерчески доступны, внедрение этих методов идет медленно. Однако вполне вероятно, что эти методы будут иметь все большее значение для разрешения клеточной ультраструктуры в будущем.

ВЫБОР ПРАВИЛЬНОГО МИКРОСКОПА ДЛЯ ВАШЕГО ЭКСПЕРИМЕНТА

При планировании микроскопического эксперимента первое, что нужно сделать, — это определить системы, к которым у вас есть доступ, и то, как они настроены; проверьте системы как в своей лаборатории, так и на основных объектах. Убедитесь, что в микроскопах есть фильтры и / или лазеры для изображения красителей, которые вы планируете использовать, и что в них есть системы инкубации для поддержания жизни клеток в течение длительного времени, если это необходимо для вашего эксперимента.

Относительные характеристики различных методов визуализации сравниваются в.В целом, для рутинной визуализации широкоугольная эпифлуоресценция является хорошей отправной точкой: она проста в использовании и имеет относительно хорошую чувствительность и скорость. Для образцов толщиной более ∼20 мкм стоит рассмотреть возможность конфокальной микроскопии, особенно если требуется высокое разрешение в Z или если образцы сильно окрашены. Конфокальная микроскопия с лазерным сканированием отлично подходит для отражения расфокусированного света и получения данных трехмерных изображений, но в целом она менее чувствительна и более фототоксична, чем конфокальная микроскопия с вращающимся диском.Для живых образцов, для которых требуется трехмерная информация, следует рассмотреть возможность использования конфокальной микроскопии с вращающимся диском. Конфокальная микроскопия с вращающимся диском также отлично подходит для получения трехмерной информации с высоким разрешением о небольших объектах, как при визуализации дрожжей с масляным объективом 100 × / 1,4 NA. Для визуализации мембран или любого другого образца, который находится в пределах нескольких сотен нанометров от покровного стекла, следует рассмотреть возможность микроскопии TIRF. Наконец, если у вас есть доступ к световому микроскопу или другому специализированному микроскопу, изучите его возможности и подумайте, подходит ли он для ваших экспериментов.

ТАБЛИЦА 1:

Характеристики методов визуализации.

Микроскоп Максимальная толщина образца Скорость Чувствительность Фототоксичность
Widefield 20 мкм ++ 9066 конфокальный 100–200 мкм + + +
Вращающийся диск конфокальный 30–50 мкм +++ +++ ++
На покровном стекле +++ +++ +++
Светлый лист > 1 мм +++ ++ +++

Производительность Работа микроскопа может сильно зависеть от деталей его компонентов и того, как он сконфигурирован.По этой причине часто имеет смысл попробовать несколько систем при проведении нового эксперимента по визуализации, чтобы определить, какая из них лучше всего соответствует вашим потребностям. Местные специалисты по микроскопии, такие как руководитель керна, часто могут помочь вам выбрать подходящий микроскоп. Вам также может потребоваться изменить флуоресцентные метки, которые вы используете, или иным образом скорректировать план эксперимента, чтобы наилучшим образом использовать микроскопы, к которым у вас есть доступ.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ РЕСУРСЫ

Микроскопия — это большая и разнообразная область с активным исследовательским сообществом, поэтому для новичка в этой области объем доступной информации может легко показаться огромным.К счастью, для начинающих микроскопистов есть отличные ресурсы. В частности, я рекомендую две книги: Основы световой микроскопии и электронной визуализации (Мерфи и Дэвидсон, 2012) дает отличное введение в предмет, а Справочник по биологической конфокальной микроскопии (Pawley, 2006) дает гораздо более подробную информацию. ссылка на многие аспекты микроскопии, особенно конфокальную микроскопию. Есть также два отличных веб-сайта, на которых есть информация по широкому кругу тем, связанных с микроскопией: микроскопия.com и micro.magnet.fsu.edu. Наконец, полный набор лекций по микроскопии доступен на сайте ibiomicroscopy.com.

Благодарности

Я благодарю Н. Стурмана, Д. Ларсена и М. Калверт за полезные комментарии к рукописи.

Используемые сокращения:

9027 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
  • Axelrod D.Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии. Движение. 2001; 2: 764–774. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чен Б.С., Легант В.Р., Ван К., Шао Л., Милки Д.Е., Дэвидсон М.В., Джанетопулос К., Ву XS, Хаммер Дж. А., 3-й, Лю Z1 и др. Решеточная световая микроскопия: визуализация молекул эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением. Наука. 2014; 346: 1257998. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Day RN, Davidson MW. Палитра флуоресцентных белков: инструменты для визуализации клеток.Chem Soc Rev.2009; 38: 2887–2921. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Дин К.М., Палмер А.Э. Достижения в стратегиях флуоресцентной маркировки для динамической клеточной визуализации. Nat Chem Biol. 2014; 10: 512–523. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Helmchen F, Denk W. Двухфотонная микроскопия глубоких тканей. Нат методы. 2005; 2: 932–940. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ху К., Джи Л., Эпплгейт К.Т., Данузер Дж., Уотерман-Сторер К.М. Дифференциальная передача движения актина внутри фокальных спаек.Наука. 2007. 315: 111–115. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хуанг Б., Бэбкок Х., Чжуан Х. Нарушение дифракционного барьера: получение изображений клеток со сверхвысоким разрешением. Клетка. 2010. 143: 1047–1058. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Иноуэ С. Основы конфокального сканирования изображений в световой микроскопии. В: Pawley JB, редактор. Справочник по биологической конфокальной микроскопии. Нью-Йорк: Спрингер; 2006. С. 1–19. [Google Scholar]
  • Jonkman JEN, Swoger J, Kress H, Rohrbach A, Stelzer EHK.Разрешение в оптической микроскопии. Методы Энзимол. 2003. 360: 416–446. [PubMed] [Google Scholar]
  • Келлер П.Дж., Аренс МБ. Визуализация активности и развития всего мозга на уровне отдельных клеток с помощью световой микроскопии. Нейрон. 2015; 85: 462–483. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мерфи Д. Б., Дэвидсон М. В.. Основы световой микроскопии и электронной визуализации. Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons; 2012. [Google Scholar]
  • Pawley JB. Справочник по биологической конфокальной микроскопии.Нью-Йорк: Спрингер; 2006. [Google Scholar]
  • Rafelski SM, Viana MP, Zhang Y, Chan Y-HM, Thorn KS, Yam P, Fung JC, Li H, Costa L da F, Marshall WF. Масштабирование размеров митохондриальной сети у почкующихся дрожжей. Наука. 2012; 338: 822–824. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Stelzer EHK. Промежуточная оптическая система лазерно-сканирующих конфокальных микроскопов. В: Pawley JB, редактор. Справочник по биологической конфокальной микроскопии. Нью-Йорк: Спрингер; 2006. С. 207–220. [Google Scholar]
  • Toomre D, Pawley JB.Дисковая сканирующая конфокальная микроскопия. В: Pawley JB, редактор. Справочник по биологической конфокальной микроскопии. Нью-Йорк: Спрингер; 2006. С. 221–238. [Google Scholar]
  • Weber M, Huisken J. Световая микроскопия для биологии развития в реальном времени. Curr Opin Genet Dev. 2011; 21: 566–572. [PubMed] [Google Scholar]
  • Wittmann T, Waterman-Storer CM. Пространственная регуляция сродства CLASP к микротрубочкам с помощью Rac1 и GSK3β в мигрирующих эпителиальных клетках. J Cell Biol. 2005; 169: 929–939. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Wu Y, Wawrzusin P, Senseney J, Fischer RS, Christensen R, Santella A, York AG, Winter PW, Waterman CM, Bao Z и др.Пространственно-изотропное четырехмерное изображение с помощью микроскопии с двойным плоскостным освещением. Nat Biotechnol. 2013; 31: 1032–1038. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Юдовски Г.А., Путенведу М.А., Генри А.Г., Застров М. фон. Карго-опосредованная регуляция быстрого пути Rab4-зависимой рециклинга. Mol Biol Cell. 2009. 20: 2774–2784. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Флуоресцентная микроскопия

Создано Джорджем Райсом, Государственный университет Монтаны

Что такое флуоресцентная микроскопия?

Флуоресцентный микроскоп во многом похож на обычный световой микроскоп с дополнительными функциями, расширяющими его возможности.

  • В обычном микроскопе используется видимый свет (400-700 нанометров) для освещения и получения увеличенного изображения образца.
  • Флуоресцентный микроскоп, с другой стороны, использует источник света гораздо большей интенсивности, который возбуждает флуоресцентные частицы в интересующем образце. Этот флуоресцентный вид, в свою очередь, излучает свет с более низкой энергией и большей длиной волны, что дает увеличенное изображение вместо исходного источника света.

Флуоресцентная микроскопия часто используется для визуализации специфических особенностей небольших образцов, таких как микробы.Он также используется для визуального улучшения трехмерных объектов в небольших масштабах. Это может быть достигнуто путем прикрепления флуоресцентных меток к антителам, которые, в свою очередь, прикрепляются к целевым признакам, или менее специфическим окрашиванием. Когда отраженный свет и фоновая флуоресценция фильтруются в этом типе микроскопии, целевые части данного образца могут быть отображены. Это дает исследователю возможность визуализировать желаемые органеллы или уникальные особенности поверхности исследуемого образца. Конфокальная флуоресцентная микроскопия чаще всего используется для подчеркивания трехмерной природы образцов.Это достигается за счет использования мощных источников света, таких как лазеры, которые можно точно сфокусировать. Эта фокусировка повторяется многократно на одном уровне образца за другим. Чаще всего программа реконструкции изображения объединяет данные многоуровневого изображения в трехмерную реконструкцию целевого образца.

Как работает флуоресцентная микроскопия?
Рисунок, показывающий фильтры и зеркало в флуоресцентном микроскопе из Википедии

В большинстве случаев интересующий образец маркируется флуоресцентным веществом, известным как флуорофор, а затем освещается через линзу более мощным источником энергии.Освещающий свет поглощается флуорофором (теперь прикрепленным к образцу) и заставляет их излучать более длинный свет с меньшей длиной волны. Этот флуоресцентный свет можно отделить от окружающего излучения с помощью фильтров, предназначенных для этой конкретной длины волны, позволяя зрителю видеть только то, что флуоресцирует.

Основная задача флуоресцентного микроскопа состоит в том, чтобы позволить возбуждающему свету излучать образец, а затем отсортировать гораздо более слабый излучаемый свет из изображения.Во-первых, у микроскопа есть фильтр, который пропускает только излучение с определенной длиной волны, которая соответствует вашему флуоресцентному материалу. Излучение сталкивается с атомами в вашем образце, и электроны возбуждаются до более высокого уровня энергии. Когда они расслабляются до более низкого уровня, они излучают свет. Чтобы стать обнаруживаемым (видимым человеческим глазом), флуоресценция, испускаемая образцом, отделяется от гораздо более яркого возбуждающего света во втором фильтре. Это работает, потому что излучаемый свет имеет более низкую энергию и большую длину волны, чем свет, который используется для освещения.

Большинство флуоресцентных микроскопов, используемых сегодня в биологии, являются эпифлуоресцентными микроскопами, что означает, что и возбуждение, и наблюдение флуоресценции происходят над образцом. Большинство из них используют ксеноновую или ртутную дуговую лампу для более интенсивного источника света.

Приложения:

Усовершенствование эпифлуоресцентных микроскопов и появление более мощных сфокусированных источников света, таких как лазеры, привело к появлению более технически совершенных прицелов, таких как конфокальные лазерные сканирующие микроскопы и флуоресцентные микроскопы полного внутреннего отражения (TIRF).

CLSM — бесценный инструмент для создания трехмерных изображений с высоким разрешением подповерхностей таких образцов, как микробы. Их преимущество состоит в том, что они могут создавать резкие изображения толстых образцов на разной глубине, снимая изображения по точкам и реконструируя их с помощью компьютера, а не просматривая целые изображения через окуляр.

Эти микроскопы часто используются для —

  • Отображение структурных компонентов небольших образцов, таких как клетки
  • Проведение исследований жизнеспособности популяций клеток (живые они или мертвые?)
  • Визуализация генетического материала внутри клетки (ДНК и РНК)
  • Просмотр конкретных клеток в большей популяции с помощью таких методов, как FISH

Литература
  • Брэдбери, С.и Evennett, P., Флуоресцентная микроскопия, Контрастные методы в световой микроскопии. , BIOS Scientific Publishers, Ltd., Оксфорд, Великобритания (1996).

Введение в световой микроскоп, методы и приложения световой микроскопии

Некоторые из самых фундаментальных процессов в природе происходят в микроскопическом масштабе, выходящем далеко за пределы того, что мы можем видеть на глаз, что мотивирует развитие технологий, позволяющих нам видеть за пределами этого предела.Еще в 4 -м веке нашей эры люди открыли основную концепцию оптических линз, а к 13-му -му -му веку они уже использовали стеклянные линзы для улучшения зрения и увеличения таких объектов, как растения и насекомые. чтобы лучше их понять. 1 Со временем эти простые увеличительные стекла превратились в передовые оптические системы, известные как световые микроскопы, которые позволяют нам видеть и понимать микроскопический мир за пределами нашего восприятия.Сегодня световая микроскопия является основным методом во многих областях науки и технологий, включая науки о жизни, биологию, материаловедение, нанотехнологии, промышленный контроль, судебную экспертизу и многие другие. В этой статье мы сначала рассмотрим основной принцип работы световой микроскопии. Основываясь на этом, мы обсудим некоторые более продвинутые формы световой микроскопии, которые обычно используются сегодня, и сравним их сильные и слабые стороны для различных приложений.

Что такое световая микроскопия?


Световая микроскопия используется для визуализации небольших структур и образцов путем получения увеличенного изображения того, как они взаимодействуют с видимым светом, например.g., их поглощение, отражение и рассеяние. Это полезно для понимания того, как выглядит образец и из чего он состоит, но также позволяет нам увидеть процессы микроскопического мира, например, как вещества диффундируют через клеточную мембрану.

Детали микроскопа и принцип работы светового микроскопа


По сути, микроскоп состоит из двух подсистем: системы освещения для освещения образца и системы визуализации, которая создает увеличенное изображение света, который взаимодействовал с образцом, который затем можно просматривать визуально или с помощью системы камер.

Ранние микроскопы использовали систему освещения, включающую солнечный свет, который собирался и отражался на образец зеркалом. Сегодня в большинстве микроскопов используются искусственные источники света, такие как лампочки, светодиоды (светодиоды) или лазеры, для создания более надежных и контролируемых систем освещения, которые можно адаптировать к конкретному применению. В этих системах свет от источника обычно собирается с помощью конденсорной линзы, затем формируется и оптически фильтруется перед фокусировкой на образце.Формирование света важно для достижения высокого разрешения и контраста и часто включает в себя управление освещаемой областью образца и углами, под которыми свет падает на нее. Оптическая фильтрация освещающего света с использованием оптических фильтров, которые изменяют его спектр и поляризацию, может использоваться для выделения определенных характеристик образца, улучшения видимости слабых сигнатур или наблюдения флуоресценции образца.


Рисунок 1: Базовый составной микроскоп: Свет от источника фокусируется на образец (объект) с помощью зеркала и конденсорной линзы.Свет от образца собирается объективом, образуя промежуточное изображение, которое снова отображается окуляром и передается в глаз, который видит увеличенное изображение образца.

Система визуализации собирает освещающий свет, который взаимодействует с образцом, и создает увеличенное изображение, которое можно увидеть (рис. 1). Это достигается за счет использования двух основных групп оптических элементов: во-первых, линзы объектива, собирающей как можно больше света от образца, и, во-вторых, линзы окуляра, которая передает собранный свет в глаз наблюдателя или в систему камеры.Система формирования изображения может также включать в себя такие элементы, как апертуры и фильтры, которые выбирают определенные части света от образца, например, чтобы видеть только свет, который был рассеян от образца, или только свет определенного цвета или длины волны. Как и в случае с системой освещения, этот тип фильтрации может быть чрезвычайно полезен для выделения определенных интересующих особенностей, которые остаются скрытыми при отображении всего света от образца.

В целом, и освещение, и система визуализации играют ключевую роль в том, насколько хорошо работает световой микроскоп.Чтобы получить максимальную отдачу от световой микроскопии в вашем приложении, важно хорошо понимать, как работает базовый световой микроскоп и какие вариации существуют сегодня.


Простые и сложные микроскопы

Одинарная линза может использоваться как увеличительное стекло, которое увеличивает видимый размер объекта, когда он находится близко к линзе. Глядя через увеличительное стекло на объект, мы видим увеличенное и виртуальное изображение объекта. Этот эффект используется в простых микроскопах, которые состоят из одной линзы, которая отображает образец, зажатый в рамке и освещенный снизу, как показано на рисунке 2.Этот тип микроскопа может достигать увеличения в 2-6 раз, что достаточно для исследования относительно больших образцов. Однако для достижения большего увеличения и лучшего качества изображения требуется использование большего количества оптических элементов, что привело к разработке составного микроскопа (рис. 3).



Рисунок 2: Одиночная линза в качестве увеличительного стекла, создавая увеличенное виртуальное изображение объекта, помещенного рядом с ним.
Рисунок 3: Слева: Простой микроскоп. Кредит: Музей Уотерса У. / Окленда. Воспроизводится по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0). Справа: составной микроскоп. Кредит: Жак из Кейптауна, Южная Африка. Воспроизводится по лицензии Creative Commons Attribution 2.0 Generic. Обрезано, чтобы выделить только один инструмент.

В составном микроскопе образец освещается снизу, чтобы наблюдать проходящий свет, или сверху, чтобы наблюдать отраженный свет. Свет от образца улавливается оптической системой, состоящей из двух основных групп линз: объектива и окуляра, индивидуальные оптические силы которых умножаются, что обеспечивает гораздо большее увеличение, чем при использовании простого микроскопа.Объектив собирает свет от образца и обычно имеет увеличение 40–100 крат. Некоторые составные микроскопы имеют несколько линз объектива на вращающейся турели, известной как «носовая часть», что позволяет пользователю выбирать между различными увеличениями. Изображение с объектива улавливается окуляром, который снова увеличивает изображение и передает его глазу пользователя, при этом типичные окуляры имеют 10-кратное увеличение. Следовательно, общее увеличение составного микроскопа, которое является произведением увеличения объектива и увеличения окуляра, обычно находится в диапазоне 400-1000 крат.

Наименьший размер элемента, который можно наблюдать с помощью стандартного светового микроскопа, определяется используемой длиной оптической волны (λ) и разрешающей способностью объектива микроскопа, определяемой его числовой апертурой (NA), с максимальным значением NA = 1. для цели в воздухе. Предел разрешения, который определяет наименьший размер элемента (r), который можно различить, определяется критерием Рэлея 2 как:

r = 0,61 × (λ / NA)


Например, при использовании зеленого света с длиной волны 550 нм и объектив с типичной числовой апертурой 0.7, стандартный световой микроскоп может разрешать детали с точностью до 0,61 × (550 нм) / 0,7 ≈ 480 нм, что достаточно для наблюдения за клетками (обычно размером 10 мкм), но недостаточно для наблюдения деталей более мелких организмов, например вирусы (обычно 250-400 нм). Для изображения более мелких деталей можно использовать более продвинутые и дорогие объективы с более высокой числовой апертурой и более короткими длинами волн, но это может оказаться нецелесообразным для всех приложений.

В стандартных составных микроскопах (рис. 4a) образец (часто на предметном стекле) удерживается на предметном столике, который можно перемещать вручную или электронным способом для большей точности, а система освещения находится в нижней части микроскопа, а система визуализации находится над образцом.Однако корпус микроскопа обычно можно адаптировать для конкретных целей. Например, стереомикроскопы (рис. 4b) оснащены двумя окулярами, расположенными под небольшим углом друг к другу, что позволяет пользователю видеть слегка трехмерное изображение. Во многих биологических приложениях используется конструкция инвертированного микроскопа (рис. 4c), где и система освещения, и оптика для визуализации находятся ниже предметного столика, чтобы облегчить размещение, например, контейнеров с культурами клеток на нем. Наконец, сравнительные микроскопы (рис. 4d) часто использовались в криминалистике, например, для сравнения отпечатков пальцев или пуль на глаз до появления цифровой микроскопии, которая позволяла сохранять и сравнивать изображения.


Рисунок 4
: Составные корпуса микроскопов. a) Стандартный вертикальный микроскоп с указателем (1) окуляра (окулярной линзы), (2) турели объектива, револьвера или вращающейся носовой части (для удержания нескольких линз объектива), (3) линз объектива, ручки фокусировки (для перемещения предметного столика) ( 4) грубая настройка, (5) точная настройка, (6) столик (для удержания образца), (7) источник света (свет или зеркало), (8) диафрагма и конденсатор, (9) механический столик. Кредит: GcG (jawp). б) Стереомикроскоп. Кредит: GcG (jawp). в) Инвертированный микроскоп. Кредит: Kitmondo LAB. Воспроизведено по лицензии Generic Creative Commons Attribution 2.0. d) Микроскоп сравнения. Кредит: Tamasflex. Воспроизведено под лицензией Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported.

Типы световой микроскопии

Далее мы представим выбор различных методов световой микроскопии, доступных сегодня, обсудим их основные принципы работы, а также сильные и слабые стороны каждого метода.


Светлопольная микроскопия

Светлопольная микроскопия (BFM) — это простейшая форма световой микроскопии, при которой образец освещается сверху или снизу, а свет, прошедший через него или отраженный от него, собирается для формирования изображения, которое можно увидеть . Контраст и цвет изображения формируются из-за того, что поглощение и отражение изменяются по площади образца. BFM была первым типом световой микроскопии, разработанной и использующей относительно простую оптическую установку, которая позволила ранним ученым изучать микроорганизмы и клетки в передаче.Сегодня он по-прежнему очень полезен для тех же целей, а также широко используется для исследования других частично прозрачных образцов, таких как тонкие материалы в режиме пропускания (рис. 5) или микроэлектроника и другие небольшие структуры в режиме отражения. Однако увеличение BFM ограничено 1300 x и не подходит для визуализации образцов с высокой прозрачностью.


Рисунок 5 : Светлопольная микроскопия. Слева: режим пропускания — чешуйки графита (темно-серый) и графена (светло-серый), как видно в светлопольном микроскопе.Здесь разница в яркости, видимая на изображении, пропорциональна толщине графитового слоя. Справа: Режим отражения — чешуйки графена и графита на поверхности SiO 2 . Также видны небольшие поверхностные загрязнения. Кредит: Автор.


Микроскопия в темном поле


Микроскопия в темном поле — это метод, при котором собирается только свет, рассеянный образцом. Это достигается за счет добавления апертур, которые блокируют прямое отображение освещающего света, так что виден только освещающий свет, рассеиваемый образцом.Таким образом, темнопольная микроскопия выделяет небольшие структуры, которые рассеивают свет (рис. 6), и может быть очень полезна для выявления особенностей, не видимых в BFM, без необходимости каким-либо образом изменять образец. Однако, поскольку единственный свет, который виден на окончательном изображении, — это свет, который был рассеян, изображения в темном поле могут быть довольно темными и требовать высокой мощности освещения, что может повредить образец.
Рис. 6:
Изображение светлого и темного поля. а) Полимерная микроструктура при освещении светлым полем.б) Изображение в темном поле той же структуры, что и в а), с выделением рассеяния по краям и загрязнения поверхности. в) Подобные структуры, как в а) и б), покрытые нанокристаллами диаметром 100-300 нм. Наблюдается только свет, рассеянный нанокристаллами, тогда как фоновый свет сильно подавлен. Кредит: Автор.

Фазово-контрастная микроскопия


Фазово-контрастная микроскопия (ФКМ) — это метод, позволяющий визуализировать изменения оптической фазы, вызванные вариациями длины оптического пути образца.Это позволяет получать изображения прозрачных образцов, которые создают небольшой контраст или не создают никакого контраста в BFM, например, клетки (рис. 7). Поскольку оптические фазовые сдвиги не наблюдаются глазом, фазово-контрастная микроскопия требует дополнительных оптических компонентов, которые преобразуют фазовые сдвиги, вызванные образцом, в видимые изменения яркости конечного изображения. Это требует манипулирования как системой освещения, так и системой формирования изображения с помощью апертур и фильтров. Они формируют и выборочно сдвигают по фазе как свет от образца, который несет интересующую фазовую информацию, так и свет подсветки, так что они конструктивно влияют на глаз или детектор, создавая видимое изображение.

Рисунок 7 : Фазово-контрастная микроскопия колонии человеческих эмбриональных стволовых клеток. Кредит Сабрина Лин, Прю Талбот, Центр стволовых клеток Калифорнийского университета, Риверсайд.

PCM.Однако, по сравнению с PCM, DICM может обеспечивать изображения с более высоким разрешением, а четкость и артефакты изображения, вносимые оптикой, необходимой для PCM, уменьшаются. В DICM освещающий луч поляризуется линейным поляризатором, и его поляризация вращается так, что он разделяется на два поляризованных луча с перпендикулярной поляризацией и небольшим (обычно менее 1 мкм) расстоянием между ними 3 . После прохождения образца оба луча объединяются так, что они мешают друг другу.Это создает изображение с контрастом, пропорциональным разности оптических фаз между двумя поляризованными лучами, отсюда и название «дифференциальная интерференционная микроскопия». Изображения, полученные с помощью DICM, кажутся трехмерными в зависимости от направления смещения между образующими пучками, что приводит к тому, что края образца имеют светлые или темные области в зависимости от знака оптической разности фаз между ними (рис. 8).

Рис. 8: Дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия.Слева: схематическая установка для DICM. Справа: живая взрослая нематода Caenorhabditis elegans ( C. elegans ), полученная с помощью DICM. Кредит: Боб Голдштейн, Библиотека изображений клеток. Воспроизводится по лицензии Creative Commons Attribution 3.0 Unported (CC BY 3.0).

Микроскопия в поляризованном свете


В микроскопии в поляризованном свете образец освещается поляризованным светом, и обнаружение света также чувствительно к поляризации. Для этого используются поляризаторы, которые управляют поляризацией освещающего света и ограничивают поляризацию, обнаруженную системой формирования изображения, только одной конкретной поляризацией.Часто поляризации освещения и обнаружения устанавливаются перпендикулярными, так что нежелательный свет фоновой подсветки, который не взаимодействует с образцом, сильно подавляется. Эта конфигурация требует двулучепреломляющего образца, который вводит поворот угла поляризации освещающего света таким образом, чтобы он мог быть обнаружен системой формирования изображения, например, для наблюдения двулучепреломления кристаллов и изменений толщины и показателя преломления поперек них (рис.9).

Рисунок 9: Поляризационная микроскопия.Микрофотография скопления оливина, образованного скоплением кристаллов с различным двулучепреломлением. Изменения толщины и показателя преломления по образцу приводят к разным цветам. Кредит: Р. Хилл, CSIRO.

Флуоресцентная микроскопия


Флуоресцентная микроскопия используется для изображения образцов, которые флуоресцируют, то есть излучают длинноволновый свет при освещении более коротковолновым светом. Примеры включают биологические образцы, которые по своей природе флуоресцентны или были помечены флуоресцентным маркером, а также отдельные молекулы и другие наноразмерные флуорофоры.В методе используется комбинация оптических фильтров, которые блокируют коротковолновый свет освещения, но пропускают более длинноволновую флуоресценцию образца, так что на конечном изображении видны только флуоресцентные части образца (рис. 10). Это позволяет выделить и визуализировать распределение интересующих флуоресцентных частиц или клеток, которые были окрашены красителем изнутри образца, состоящего из многих других нефлуоресцентных частиц. В то же время флуоресцентная микроскопия может также преодолеть предел разрешающей способности традиционных оптических микроскопов, помечая частицы, размер которых меньше этого предела.Например, вирусы могут быть помечены флуоресцентными маркерами, чтобы выявить их местоположение 4 или флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок, 5 может быть экспрессирован в случае биологических образцов. В сочетании с различными новыми формами освещения образцов это преимущество флуоресцентной микроскопии позволяет использовать методы микроскопии с «сверхвысоким разрешением» 6 , которые выходят за пределы разрешающей способности традиционной световой микроскопии. Одним из основных ограничений флуоресцентной микроскопии является фотообесцвечивание, когда маркеры или частицы перестают флуоресцировать, потому что процесс поглощения освещающего света в конечном итоге изменяет их структуру, так что они больше не излучают свет.

Рисунок 10 : Флуоресцентная микроскопия. Слева: Принцип работы — осветительный свет фильтруется короткопроходным возбуждающим фильтром и отражается к образцу дихроичным зеркалом. Флуоресценция образца проходит через дихроичное зеркало и дополнительно фильтруется эмиссионным фильтром для удаления остаточного возбуждающего света с изображения. Справа: флуоресцентное изображение молекул, заключенных в органический кристалл (контур кристалла показан желтым пунктиром). Фон не совсем темный из-за флуоресценции других молекул и кристаллического материала. Кредит: Автор.


Иммунофлуоресцентная микроскопия


Иммунофлуоресцентная микроскопия — это особый вариант флуоресцентной микроскопии, который в основном используется в микробиологии для визуализации расположения биомолекул внутри клетки. Здесь антитела, помеченные флуоресцентными маркерами или по своей природе флуоресцентные, связываются с интересующими биомолекулами, выявляя их местоположение. 7

Рисунок 11: Иммунофлуоресцентная микроскопия. Две интерфазные клетки с иммунофлуоресцентной меткой актиновых филаментов (фиолетовый), микротрубочек (желтый) и ядер (зеленый). Предоставлено: Торстен Виттманн, Галерея изображений NIGMS.


Конфокальная микроскопия


Конфокальная микроскопия — это метод микроскопии, который позволяет получать изображения рассеяния или флуоресценции от образца точка за точкой. Вместо одновременного освещения и визуализации всего образца, пятно освещения, исходящее от точечного источника, сканируется по области образца, и только свет из этой точки обнаруживается чувствительным детектором, создавая двухмерное изображение. Этот подход позволяет получать изображения образцов со слабыми сигналами с высоким разрешением, поскольку нежелательные фоновые сигналы, идущие за пределами точки выборки, эффективно подавляются.Здесь длина волны и используемый объектив ограничивают размер пятна изображения во всех трех измерениях. Это позволяет делать 2D-изображения на разной глубине внутри образца, перемещая объектив на разное расстояние от образца. Эти «срезы» двухмерного изображения можно затем объединить для создания трехмерного изображения образца, что невозможно с другими обсуждаемыми методами широкоугольной микроскопии, а также позволяет измерять размеры образца в трехмерном пространстве. Эти преимущества достигаются за счет невозможности получить изображение за один снимок, а вместо этого необходимо создавать изображение по пунктам, что может занять много времени и препятствовать построению изображения образца в реальном времени (рис. 12).
Рисунок 12 : Конфокальное флуоресцентное изображение флуоресценции одиночной молекулы. Маленькие пятна соответствуют флуоресценции отдельных молекул, а более крупные — кластерам молекул. Фон флуоресценции здесь намного слабее, чем на простом изображении с флуоресцентного микроскопа, что видно по темным областям между яркими пятнами. Кредит: Автор.

Двухфотонная микроскопия


Двухфотонная микроскопия (TPM) — это разновидность флуоресцентной микроскопии, в которой для возбуждения флуоресценции используется двухфотонное поглощение вместо однофотонного возбуждения.Здесь флуоресценция возбуждается путем поглощения комбинации двух фотонов примерно половиной энергии, необходимой для возбуждения одним фотоном. Например, флуорофор, который обычно возбуждается одиночными голубыми фотонами, может быть возбужден двумя фотонами ближнего инфракрасного диапазона в этой схеме. В TPM изображение создается точка за точкой, как и в конфокальной микроскопии, то есть пятно двухфотонного возбуждения сканируется по образцу, а флуоресценция образца регистрируется чувствительным детектором. Большая разница в энергии возбуждения и флуоресценции дает множество преимуществ по сравнению с традиционной флуоресцентной микроскопией: во-первых, она позволяет использовать более длинные волны возбуждения, которые меньше рассеиваются внутри образца и, таким образом, проникают более глубоко, что позволяет визуализировать образец под его поверхностью и создавать образцов трехмерных изображений.В то же время фотообесцвечивание значительно снижается, поскольку энергия возбуждения намного ниже, что полезно для хрупких образцов. Фон флуоресценции вокруг пятна возбуждения также значительно снижается, поскольку эффективное двухфотонное поглощение происходит только в фокусе возбуждающего луча, так что можно наблюдать флуоресценцию от небольших участков образца (рис. 13).

Недостатком TPM является то, что вероятность двухфотонного поглощения намного ниже, чем однофотонного поглощения, и, следовательно, для достижения практической интенсивности сигнала флуоресценции требуется высокоинтенсивное освещение, такое как импульсные лазеры.

Рисунок 13: Двухфотонная микроскопия. Тонкий оптический срез пыльцы, демонстрирующий флуоресценцию, в основном формирует внешние слои. Кредит: Майкл Каммер, Библиотека изображений клеток.


Световая микроскопия


Световая микроскопия — это форма флуоресцентной микроскопии, при которой образец освещается тонким «листом» света, перпендикулярным направлению наблюдения, так что только тонкий участок (обычно несколько микрометров) образца. 8 Делая последовательность изображений, в то время как образец вращается в световом листе, можно сформировать трехмерное изображение. Для этого требуется, чтобы образец был в основном прозрачным, поэтому этот метод часто используется для формирования трехмерных изображений небольших прозрачных биологических структур, таких как клетки, эмбрионы и организмы, такие как рыба-зебра 9 (рис. 14). Рисунок 14: Световая микроскопия. Слева: принцип работы. Справа: флуоресцентное изображение мозга мыши, полученное с помощью световой микроскопии с помощью флуоресцентной визуализации. Предоставлено: Fenerliabi11, Wikimedia Commons. Воспроизводится по международной лицензии Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 (CC BY-SA 4.0).

Флуоресцентная микроскопия с полным внутренним отражением

Флуоресценция с полным внутренним отражением (TIRF) — это метод флуоресцентной микроскопии, который позволяет получать двумерные флуоресцентные изображения очень тонких (толщиной примерно 100 нм) срезов образца. 10 Это достигается за счет возбуждения флуоресценции образца исчезающими полями освещающего света, которые возникают, когда он подвергается полному внутреннему отражению на границе между двумя материалами с разным показателем преломления (n).Светящиеся поля имеют ту же длину волны, что и освещающий свет, но тесно связаны с границей раздела. В микроскопии TIRF возбуждающий свет обычно подвергается полному внутреннему отражению на границе раздела между предметным стеклом (n = 1,52) и водной средой (n = 1,35), в которой диспергирован образец. Интенсивность затухающего поля экспоненциально спадает с расстоянием от интерфейса, так что на окончательном изображении наблюдаются только флуорофоры, закрывающие поверхность раздела. Это также приводит к сильному подавлению фона флуоресценции от областей за пределами среза, что позволяет улавливать слабые сигналы флуоресценции, например, при локализации отдельных молекул.Это делает TIRF чрезвычайно полезным для наблюдения за слабым сигналом флуоресцентных белков (рис. 15), участвующих в межклеточных взаимодействиях, но также требует, чтобы образец был диспергирован в водной среде, что может ограничивать типы образцов, которые могут быть измерены.


Фиг. 15: изображение TIRF, показывающее флуоресценцию белка в культивируемых клетках пигментного эпителия сетчатки. Каждый пиксель соответствует 67 нм. Кредит: Аллен Лю, Сандра Л. Шмид, Библиотека изображений клеток.

Расширяющая микроскопия


Основная идея экспансионной микроскопии заключается в увеличении размера образца, для которого обычно требуются микроскопы с высоким разрешением, чтобы его можно было визуализировать с помощью стандартных методов микроскопии, в частности флуоресцентной микроскопии.Это хорошо работает для консервированных образцов, таких как биомолекулы, клетки, бактерии и срезы ткани, которые могут быть увеличены одинаково во всех измерениях (изотропно) до 50 раз с помощью химического процесса 11 , показанного на рисунке 16. Расширение образцов позволяет изоляция отдельных интересующих элементов, которые обычно скрыты и могут сделать их прозрачными, позволяя отображать их внутреннюю часть.

Рисунок 16 : Подготовка образца для экспансионной микроскопии.Клетка сначала окрашивается, а затем связывается с матрицей полимерного геля. Сама клеточная структура затем растворяется (переваривается), позволяя окрашенным частям изотропно расширяться с гелем, что позволяет отобразить окрашенную структуру с более детальной визуализацией.

Деконволюция в световой микроскопии


Помимо адаптации оптической системы к конкретному случаю использования, современная световая микроскопия также использует преимущества цифровой обработки изображений, например, деконволюции изображений. 12 Этот метод позволяет увеличить пространственное разрешение, а также точность локализации изображений, полученных с помощью оптического микроскопа, за счет компенсации размытия, присущего самой оптической системе.Это размытие можно измерить на этапе калибровки, а затем можно использовать для деконволюции изображения, тем самым уменьшая размытость. Цифровая микроскопия 13 , сочетающая в себе высокопроизводительную оптику с передовыми технологиями обработки изображений, может раздвинуть границы разрешающей способности и заглянуть еще дальше в мир микроскопии.

Рисунок 17: Деконволюция изображения. Слева: исходное флуоресцентное изображение. Справа: изображение после деконволюции, демонстрирующее повышенную детализацию. Кредит: Автор.

Световая микроскопия и электронная микроскопия


В световой микроскопии обычно используются длины волн видимого спектра, что по своей сути ограничивает ее пространственное разрешение из-за критерия Рэлея примерно половиной используемой длины волны (примерно 200 нм в лучшем случае) .Однако даже при использовании объективов с высокой числовой апертурой и расширенной обработкой изображений этот фундаментальный предел невозможно преодолеть. Вместо этого для наблюдения за меньшими структурами требуется использование электромагнитного излучения с более короткой длиной волны. Это основной принцип электронной микроскопии, в которой для освещения образца используются электроны вместо видимого света. Электроны имеют соответствующую длину волны, которая намного короче, чем видимый свет, что позволяет достичь увеличения до 10 000 000 x, так что даже отдельные атомы могут быть разделены. 14
Рис. 18: Изображение, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа при 15000-кратном увеличении, нанокристалла в концентрической полимерной структуре. Разрешаются даже мелкие детали, такие как поры основы. Кредит: Автор.

Резюме и заключение


Световая микроскопия — мощный инструмент для исследования небольших образцов в широком диапазоне приложений. Приспосабливая методы освещения и визуализации, используемые для конкретного случая использования, можно получить изображения с высоким разрешением, дающие представление о микроскопических структурах и процессах в образце.В этой статье мы обсудили особенности, сильные и слабые стороны различных методов световой микроскопии, которые различаются по способу попадания и сбора света.

Таблица сравнения методов световой микроскопии


3D трехмерный
DIC Дифференциальный интерференционный контраст
NA числовая апертура
числовая апертура
TIRF полное внутреннее отражение
  • 9065

  • Методика

    Преимущества

    Ограничения

    Типичные области применения

    Микроскопия в темном поле

    Выявляет мелкие структуры и шероховатость поверхности, позволяет визуализировать неокрашенные образцы

    Требуемая высокая мощность освещения может повредить образец, видны только элементы рассеянного изображения

    Визуализация частиц в клетках, 17 осмотр поверхности 18

    Фазово-контрастная микроскопия

    Обеспечивает визуализацию прозрачных образцов

    Сложная оптическая установка, необходимая высокая мощность освещения может повредить образец, обычно более темные изображения

    Отслеживание движения клеток, 19 визуализация личинок 20

    Дифференциальная интерференция Контрастная микроскопия

    Разрешение выше, чем у PCM

    Сложная оптическая установка, требуется высокая мощность освещения, может повредить образец, как правило, более темные изображения

    Визуализация живых, неокрашенных клеток с высоким разрешением 21 и наночастиц 22

    Микроскопия в поляризованном свете

    Сильное подавление фона из-за отсутствия двулучепреломления образца толщина и двойное лучепреломление

    Требуется образец двойного лучепреломления

    Визуализирующий коллаген, 23 , выявляющий границы зерен в кристаллах 24

    Флуоресцентная микроскопия интерес к образцу, который необходимо выделить, может преодолеть предел разрешения

    Требуется флуоресцентный образец и чувствительный детектор, фотообесцвечивание может уменьшить сигнал

    Визуализация клеточных компонентов, одиночных молекул, белков 25

    Иммунофлуоресцентная микроскопия

    Визуализация конкретных биомолекул с использованием антител, нацеленных на

    90

    , требуется интенсивная подготовка флуоресцентных образцов

    Идентификация и отслеживание клеток 26 и белков 27

    Конфокальная микроскопия

    Низкий фоновый сигнал, возможно создание 3D-изображений

    002 Низкая скорость визуализации 9, требуется сложная оптическая система 9, требуется сложная оптическая система

    Трехмерная визуализация клеток, образцы изображений со слабыми сигналами флуоресценции, профилирование поверхности 28 .

    Двухфотонная микроскопия

    Глубокое проникновение в образец, низкий фоновый сигнал, меньшее фотообесцвечивание

    Низкая скорость визуализации, требует сложной оптической системы и мощного освещения

    9000 29 визуализация глубоких тканей 30

    Световая микроскопия

    Изображения только очень тонкого среза образца, можно создавать трехмерные изображения путем вращения образца

    Медленная скорость визуализации, требует сложной оптической системы

    Трехмерное изображение клеток и организмов 8

    Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

    Сильный фон d подавление, очень тонкое вертикальное сечение

    Визуализация ограничена тонкой областью образца, требует сложной оптической системы, образец должен находиться в водной среде

    Визуализация одиночных молекул, 31 визуализация молекулярного трафика 32

    Расширяющая микроскопия

    Повышает эффективное разрешение стандартной флуоресцентной микроскопии

    Требуется химическая обработка образца, не подходит для живых образцов

    Визуализация биологических образцов с высоким разрешением 000

    B

    Ссылки

    1.Рохов Т.Г., Такер П.А. Краткая история микроскопии. В: Введение в микроскопию с помощью света, электронов, рентгеновских лучей или акустики . Springer US; 1994: 1-21. DOI: 10.1007 / 978-1-4899-1513-9_1
    2. Smith WJ. Современная оптическая инженерия: проектирование оптических систем . Макгроу-Хилл; 1990. ISBN: 0070591741
    3. Шрибак М., Иноуэ С. Ориентационно-независимая дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия. Собрание сочинений Шинья Иноуэ: микроскопы, живые клетки и динамические молекулы. 2008; (Dic): 953-962. DOI: 10.1142 / 97898127

    _0074


    4. Гао Г., Цзян Ю.В., Сунь В., Ву Ф.Г. Флуоресцентные квантовые точки для визуализации микробов. Chinese Chem Lett. 2018; 29 (10): 1475-1485. doi: 10.1016 / j.cclet.2018.07.004
    5. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward W, Prasher D. Зеленый флуоресцентный белок как маркер экспрессии генов. Наука . 1994; 263 (5148): 802-805. doi: 10.1126 / science.8303295
    6. Баранов М. В., Олеа Р. А., ван ден Богаарт Г. Погоня за поглощением: микроскопия сверхвысокого разрешения при эндоцитозе и фагоцитозе. Trends Cell Biol . 2019; 29 (9): 727-739. DOI: 10.1016 / j.tcb.2019.05.006
    7. Миллер Д.М., Шейкс Д.К. Глава 16 Иммунофлуоресцентная микроскопия. В: Текущие протоколы Основные лабораторные методы . Том 10 .; 1995: 365-394. DOI: 10.1016 / S0091-679X (08) 61396-5
    8. Хьюскен Дж., Свогер Дж., Дель Бене Ф., Виттбродт Дж., Стельцер Э. Х. Оптические срезы глубоко внутри живых эмбрионов с помощью микроскопии с селективным освещением. Наука . 2004; 305 (5686): 1007-1009. DOI: 10.1126 / наука.1100035
    9. Хьюскен Дж. Аккуратное нарезание эмбрионов листами лазерного излучения. БиоЭссе . 2012; 34 (5): 406-411. doi: 10.1002 / bies.201100120
    10. Рыба К.Н. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF). Curr Protoc Cytom. 2009; 50 (1): 273-275. DOI: 10.1002 / 0471142956.cy1218s50
    11. Васи А.Т., Чжао Ю., Бойден Э.С. Расширяющая микроскопия: принципы и использование в биологических исследованиях. Нат Методы . 2019; 16 (1): 33-41. DOI: 10.1038 / s41592-018-0219-4
    12.Лам Ф, Кладьер Д., Гийом С., Вассманн К., Болт С. Сверхвысокое разрешение для всех: рабочий процесс обработки изображений для получения изображений с высоким разрешением с помощью стандартного конфокального микроскопа. Методы . 2017; 115: 17-27. doi: 10.1016 / j.ymeth.2016.11.003
    13. Хедват С. В. Цифровая микроскопия: прошлое, настоящее и будущее. Arch Pathol Lab Med. 2010; 134 (11): 1666-1670. DOI: 10.5858 / 2009-0579-RAR1.1
    14. Фатерманс Дж., ден Деккер А. Дж., Мюллер-Каспари К. и др. Обнаружение одиночного атома по изображениям, полученным с помощью электронной микроскопии с низким отношением контрастности к шуму. Phys Rev Lett. 2018; 121 (5): 56101. DOI: 10.1103 / PhysRevLett.121.056101
    15. Чжан Ч., Хубер Ф., Кноп М., Хампрехт Ф.А. Обнаружение и сегментация дрожжевых клеток в светлопольной микроскопии. В: 2014 IEEE 11-й Международный симпозиум по биомедицинской визуализации (ISBI) ; 2014: 1267-1270. DOI: 10.1109 / ISBI.2014.6868107
    16. Наир Р.Р., Блейк П., Григоренко А.Н. и др. Константа тонкой структуры определяет визуальную прозрачность графена. Наука . 2008; 320 (5881): 1308-1308. DOI: 10.1126 / science.1156965
    17. Xu D, He Y, Yeung ES. Прямая визуализация трансмембранной динамики отдельных наночастиц с помощью микроскопии темного поля: улучшенное отслеживание ориентации на боковой стенке клетки. Anal Chem. 2014; 86 (7): 3397-3404. DOI: 10.1021 / ac403700u
    18. Ной-Бейкер Н.М., Дозьер А.К., Истлейк А.С., Бреннер С.А. Оценка расширенной микроскопии темного поля и гиперспектральной визуализации для быстрого скрининга наноразмерных частиц TiO 2 и SiO 2 , захваченных на фильтрующих материалах. Microsc Res Tech . doi: 10.1002 / jemt.23856
    19. Ли К., Миллер Э.Д., Вайс Л.Е., Кэмпбелл П.Г., Канаде Т. Отслеживание мигрирующих и пролиферирующих клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. В: , 2006 Конференция по компьютерному зрению и распознаванию образов, семинар (CVPRW’06) ; 2006: 65. doi: 10.1109 / CVPRW.2006.150
    20. Макфадзин Дж. А., Смайлс Дж. Исследования Litomosoides carinii с помощью фазово-контрастной микроскопии: развитие личинок. Дж. Гельминтол . 1956; 30 (1): 25-32.DOI: 10.1017 / S0022149X00032946
    21. Sun W, Wang G, Fang N, Yeung ES. Зависимая от длины волны дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия: выборочная визуализация зондов наночастиц в живых клетках. Анальный Химик . 2009; 81 (22): 9203-9208. doi: 10.1021 / ac 3b
    22. Сяо Л., Ха Дж. В., Вэй Л., Ван Г., Фанг Н. Определение полной трехмерной ориентации одиночных анизотропных наночастиц с помощью дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии. Angew Chemie Int Ed . 2012; 51 (31): 7734-7738.DOI: 10.1002 / anie.201202340
    23. Wolman M, Kasten FH. Поляризованная световая микроскопия в изучении молекулярной структуры коллагена и ретикулина. Гистохимия . 1986; 85 (1): 41-49. doi: 10.1007 / BF00508652
    24. Сламова М., Оченашек В., Вандер Воорт Г. Микроскопия в поляризованном свете: использование в исследовании рекристаллизации алюминиевых сплавов. Mater Charact . 2004; 52 (3): 165-177. DOI: 10.1016 / j.matchar.2003.10.010
    25. Lichtman JW, Conchello J-A. Флуоресцентная микроскопия. Нат Методы . 2005; 2 (12): 910-919. doi: 10.1038 / nmeth817
    26. Франке В., Аппельханс Б., Шмид Э., Фройденштейн С., Осборн М., Вебер К. Идентификация и характеристика эпителиальных клеток в тканях млекопитающих с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием антител к прекератину. Дифференциация . 1979; 15 (1-3): 7-25. doi: 10.1111 / j.1432-0436.1979.tb01030.x
    27. Сето С., Лай-Шмитт Г., Кенри Т., Мията М. Визуализация прикрепляющей органеллы и белков цитадергенции Mycoplasma pneumoniae с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Дж. Бактериол . 2001; 183 (5): 1621-1630. DOI: 10.1128 / JB.183.5.1621-1630.2001
    28. Поли Дж., Поли Дж. Б.. Справочник по биологической конфокальной микроскопии . 2006; (август 2010). DOI: 10.1007 / 978-0-387-45524-2
    29. Ellis-Davies GCR. Двухфотонная микроскопия для химической неврологии. ACS Chem Neurosci. 2011; 2 (4): 185-197. DOI: 10.1021 / cn100111a
    30. Helmchen F, Denk W. Двухфотонная микроскопия глубоких тканей. Нат-методы . 2005; 2 (12): 932-940. DOI: 10,1038 / nmeth818
    31.Сако Ю., Уэмура Т. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения для визуализации одиночных молекул в живых клетках. Функция клеточной структуры . 2002; 27 (5): 357-365. doi: 10.1247 / csf.27.357
    32. Аксельрод Д. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии. Трафик . 2001; 2 (11): 764-774. DOI: 10.1034 / j.1600-0854.2001.21104.x

    Фильтр для микроскопа 26 мм (зеленый) | View Solutions Microscope Store

    Цветовой фильтр — это тип фильтра, который пропускает свет только определенной длины волны и цветового диапазона, в то время как свет других длин волн улавливается.Цветной фильтр изготовлен из цветного стекла и имеет различную ширину полосы и цвет для выбора.
    И искусственный источник света (свет лампы), и естественный свет (дневной свет) являются полноцветными, включая семь цветов, а именно красный, оранжевый, желтый, зеленый, синий, индиго и пурпурный. Что касается освещения микроскопа, разные типы источников света имеют разную цветовую температуру и яркость. Чтобы отрегулировать цвет источника света, необходимо установить фильтрующее устройство на выходном отверстии источника света, чтобы спектр определенного диапазона длин волн передавался или блокировался.Цветовой фильтр обычно может быть добавлен к тракту освещения только для изменения цвета источника освещения и улучшения контрастности изображения, но обычно он не устанавливается в системе тракта формирования изображения, что влияет на качество изображения.

    Есть много типов цветных фильтров. Помимо требований к цвету, цветовые фильтры разных цветов также влияют на качество изображения. Цветные фильтры, использующие тот же цвет, сделают цвет изображения ярче.

    Что касается традиционного дневного светофильтра, то в свете лампы относительно больше красного и желтого света, разрешение невысокое и наблюдение неудобно.Использование фильтра дневного света может поглощать цвет от желтого до красного спектра, излучаемый источником света, таким образом, цветовая температура становится намного ближе к дневному свету, что делает наблюдение под микроскопом более комфортным, и это один из наиболее часто используемых цветных фильтров микроскопа.
    Фильтр синего света для дневного света может приблизиться к спектру дневного света, получить более коротковолновое освещение и улучшить разрешение линзы объектива. Например, использование фильтра синего цвета (λ = 0,44 мкм) может улучшить разрешение на 25%, чем фильтр зеленого цвета (λ = 0.55 мкм). Следовательно, фильтр синего цвета может улучшить разрешение и улучшить эффект изображения, наблюдаемый под микроскопом. Однако человеческий глаз чувствителен к зеленому свету с длиной волны около 0,55 мкм. При использовании синих цветных фильтров для микрофотографии часто бывает непросто сфокусироваться на проекционном экране.
    Желтый и зеленый фильтры: желтый и зеленый фильтры могут увеличить контраст (т.е. коэффициент контрастности) деталей образца. Что касается ахроматической линзы объектива, аберрации в желтой и зеленой полосах исправляются лучше.Следовательно, когда используются фильтры желтого и зеленого цветов, пропускаются только желтый и зеленый свет, и аберрация уменьшается, тем самым улучшая качество изображения. Для полуапохроматических и апохроматических объективов фокус видимого света концентрируется. В принципе, можно использовать любой цветной фильтр, но если использовать желтый и зеленый фильтры, цвет заставит человеческий глаз чувствовать себя комфортно и мягко.
    Красный фильтр. Красный цвет имеет самую длинную длину волны и самое низкое разрешение в видимом свете.Однако изображение в красном свете может фильтровать и устранять пестрый фон изображения. Таким образом, он имеет очень хороший эффект для некоторых приложений, которые не требуют цветовых функций для идентификации, а края и контуры изображения также являются наиболее четкими, что является более точным для измерения.

    Какой светофильтр лучше использовать в световом микроскопе: Светофильтры для микроскопа

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.

    Пролистать наверх