Колориметрическая шкала: Пусть качество ваших томатов соответствует требованиям

Некоторые методы окраски, включая «Бета», «Заряд» и «Занятость», описывает диапазон значений с плавающей запятой, а не набор имен.Они окрашены с помощью цветовой шкалы , которая является список из 1024 плавно меняющихся цветов. Есть много цветовых градаций имеется в наличии. Все они состоят из трансформаций трех цветов. Например, « RGB » окрашивает наименьшее значение в красный цвет, значения рядом с середина шкалы — зеленый цвет, а наибольшие значения — синий. Промежуточные цвета представляют собой линейные смеси двух цветов. Список доступные градации приведены ниже.

Минимум диапазона значений линейно масштабируется и смещается в начинаются с 0 и заканчиваются 1.Предположим, что цветовая шкала — RGB. Для данного значение x в диапазоне шкалы [0..1], сначала находится значение RGB из линейного масштабирования на основе средней точки. Если x 0, R равно 1 (для максимального красного). Это продолжается линейно до тех пор, пока x средняя точка, в которой R равно 0 и остается 0. Зеленый компонент равен 0 как для x 0, так и для x 1 и равен 1 для середина. Между ними происходит линейное масштабирование. Синий компонент равен 0 для средней точки x и 1 для x 1.

Дополнительный термин, « мин », добавляется к каждому из составляющих терминов. до того, как они будут объединены. Это смещает окончательные цвета ближе к белый или черный. Мин может принимать значения от -1 до 1.

Одновременно используется только одна цветовая шкала, поэтому невозможно отображать объекты, раскрашенные несколькими разными цветовыми шкалами.

— обзор | Темы ScienceDirect

6.2.1 Колориметры

Колориметр может измерять поглощающую способность световых волн. Во время измерения цвета измеряется изменение интенсивности электромагнитного излучения в видимой области длин волн спектра после передачи или отражения от объекта или раствора.Такое измерение может помочь найти концентрацию веществ, поскольку количество и цвет поглощенного или прошедшего света зависит от свойств раствора, включая концентрацию в нем частиц. Колориметр — это инструмент, который сравнивает количество света, проходящего через раствор, с количеством света, которое может пройти через образец чистого растворителя. Колориметр содержит фотоэлемент, который может определять количество света, проходящего через исследуемый раствор.Ток, создаваемый фотоэлементом, зависит от количества света, падающего на него после прохождения через окрашенный раствор. Чем выше концентрация красителя в растворе, тем выше поглощение света; меньше света, проходящего через раствор, означает меньший ток, создаваемый фотоэлементом. Колориметр снимает три широкополосных показания в видимом спектре, чтобы получить приблизительную оценку образца цвета. Традиционно слово «колориметр» используется для обозначения устройства с тремя фильтрами, которое имитирует зрение человека.Колориметры можно разделить на два типа:

•

Visual

•

Фотоэлектрические.

Визуальные колориметры бывают двух типов:

•

Визуальные измерители поглощения / компараторы цвета

•

Истинный визуальный колориметр или трехцветный колориметр.

Первый тип сравнивает цвет испытуемого образца, обычно жидкого, с цветом стандарта и находит соответствие между ними.Такие инструменты используются для химического анализа, определения концентрации и классификации по цвету.

Трехцветный колориметр подчеркивает визуальную эквивалентность или психофизическую оценку (см. Раздел 7.2). В этом приборе лучистая энергия от источника света падает на объект. Отраженная мощность излучения проходит через один из трех трехцветных фильтров и попадает на фотодетектор, заставляя его давать отклик, пропорциональный соответствующему значению трехцветного излучения комбинации объект-источник.Эти необработанные данные затем передаются в микропроцессор для вычисления абсолютных трехцветных значений CIE. Это полезный инструмент для наблюдения за производством цветного объекта. Большинство коммерческих трехцветных колориметров являются достаточно точными, но их измерения могут не совпадать со значениями цветового стимула, полученными спектрофотометрией.

Самый старый и простой компаратор цвета — это трубка Несслера, которая была разработана в колориметр Duboscq. Колориметр этого типа может сравнивать только оптические свойства растворов определенного красящего вещества, но это все, что требуется во многих тестах для оценки цвета.На рисунке 6.2 показана конструкция прибора. Имеются две вертикальные ячейки, в которых находятся эталонный и тестовый растворы с одинаковым красителем, но с разными концентрациями. Два подвижных стеклянных поршня могут использоваться для изменения длины пути L ₁ и L ₂ поглощающих растворов до тех пор, пока цвета в обоих полях окуляра не станут одинаковыми. Применяя закон Бера – Ламберта, концентрацию неизвестного раствора можно определить, умножив концентрацию известного раствора на отношение длин пути.Согласно приведенному выше закону, когда цвет обоих растворов кажется одинаковым, каждый из световых лучей должен пройти через одинаковое количество молекул, и это число напрямую связано с концентрацией раствора, умноженной на длину пути (Уравнение [ 6.1]), т.е.

6.2. Колориметр Duboscq.

[6.1] C1 × L1 = C2 × L2orC1 = C2 × L2L1

Если известна концентрация C ₂ , мы можем легко вычислить другую концентрацию. Точность измерения зависит от визуального восприятия наблюдателя.Поэтому в абсорбционном измерителе Хильгера – Спеккера визуальная оценка была заменена измерением с помощью фотоэлементов. Калиброванный световой затвор был отрегулирован до тех пор, пока электрический выход не совпадал с выходным сигналом тестового света. Равенство обеспечивалось при отсутствии прогиба гальванометра.

Истинные колориметры определяют цвета на основе их собственных основных цветов. Ряд колориметров был специально разработан для исследования цветового зрения. Они были очень сложными, дорогостоящими и узкоспециализированными, чтобы служить одной или ограниченному количеству целей.Самым ранним истинным колориметром был цветной ящик Клерка Максвелла (1860 г.), состоящий из призматического блока с регулируемыми прорезями в соответствующих частях светового пути для независимого контроля количества красных, зеленых и синих световых лучей, рассматриваемых как однородный цвет в оптическом диапазоне. блок просмотра, чтобы он соответствовал цвету образца, показанного на другой половине оптического блока. Относительные площади апертуры x, y и z записывались как сумма трех основных цветов.

Три известных визуальных трехцветных колориметра, которые использовались в Великобритании для исследования различных аспектов нормального цветового зрения, принадлежали Гильдии (1925), Райту (1927) и Дональдсону (1935).Гильдия использовала источник лампы накаливания и три цветных светофильтра. Дональдсон использовал похожие цветные фильтры. Райт использовал сложную оптическую систему для отделения трех длин волн, а именно 460, 530 и 650 нм, от белого света для использования в качестве основных цветов. Однако они дают метамерное совпадение, и результаты варьируются от наблюдателя к наблюдателю. Дональдсон (1947) модифицировал инструмент, используя шесть основных цветов, чтобы преодолеть проблему метамерии. Этот прибор использовался для полевых испытаний функций согласования цвета 2 ° и 10 ° (Wyszecki, 1964).Он потерял популярность из-за сложности калибровки и плохой освещенности поля. Однако некоторые из его основных характеристик были сохранены в конструкциях других инструментов.

Бинокулярный колориметр MacAdam (MacAdam, 1950) обеспечивал большое двудольное поле для одновременного просмотра обоими глазами. Инструмент состоял из двух симметричных частей, каждая из которых могла использоваться для спектрального согласования с цветовым стимулом другой частью. Колориметр с семью полями Вышецкого (Wyszecki, 1965) был разработан с набором из семи полей зрения для просмотра обоими глазами.Инструмент был разработан в основном для исследований, где требовалось более двух полей зрения, таких как изучение соответствия цветовых различий, эллипсов согласования цветов, согласования оттенков и т.д. с точки зрения затрат, времени и необходимых навыков. Колориметр Бернхема (Burnham, 1952) относительно прост по конструкции и использует аддитивное смешение первичных стимулов, состоящее из цветных фильтров и источника света.Прозрачный диск (рис. 6.3) разделен на три сектора с цветными фильтрами: красный (R), зеленый (G) или синий (B). Диск может свободно вращаться вокруг центральной оси, а ось может перемещаться по горизонтали, изменяя свое положение относительно неподвижного кругового луча белого света, показываемого небольшой круглой пластиной с отверстиями, центр которой находится в том же вертикальном положении, что и центр диска. После прохождения диска свет от луча смешивается за счет многократных отражений:

6.3. Колориметр Бернама с красным, зеленым, синим фильтрами и диафрагмой. (Различные количества R, G и B в смеси дают белый, желтый, оранжевый и другие цвета.)

1.

Когда луч и диск концентричны, вращение диска не происходит. Пропускание фильтров и их относительный угловой размер можно отрегулировать так, чтобы смесь имела координаты подходящего эталонного белого цвета (рис. 6.3a).

2.

Когда диск перемещается горизонтально внутри луча, относительные части трех основных цветов изменяются (рис.6.3b).

3.

Вращение диска меняет цвет (рис. 6.3c).

4.

Насыщенность цвета монотонно изменяется в зависимости от эксцентриситета диска.

Компаратор Lovibond — это тип колориметра, произведенный в Великобритании компанией Tintometer Ltd. Он был изобретен в девятнадцатом веке Джозефом Уильямсом Ловибондом, и его обновленные версии все еще доступны. Колориметр Lovibond (1870–1880) по-прежнему остается популярным коммерческим визуальным колориметром даже после 100 лет использования и развития (Lovibond, 1887; Chamberlin and Chamberlin, 1980).Колориметры Lovibond используются для анализа таких продуктов, как пищевые и промышленные масла, производные масел, жидкие химикаты, краски для транспортных средств и покрытия. Они основаны на субтрактивном смешивании цветов цветных стеклянных фильтров. Есть 250 стеклянных фильтров Lovibond для каждого из трех основных цветов, а именно пурпурного, желтого и голубого, которые имеют очень постоянный характер. Фильтры градуированы таким образом, что два стакана «1,0» соответствуют стакану «2,0» и бесцветному стеклу. Равные значения всех трех вместе дают серию от серого до черного.

Поместив подходящие фильтры Ловибонда в светофильтры на пути света, можно сопоставить почти девять миллионов цветов различной яркости. Фактически, может быть покрыта вся видимая цветовая гамма, за исключением очень насыщенной зеленой области. Эта область теперь может быть покрыта голубым источником света в соответствующем поле вместо обычного северного дневного источника света. Цвет оценивается путем визуального сопоставления образцов, таких как цвета поверхности или прозрачные образцы, включая жидкости, хранящиеся в поле образца, и цветные фильтры на пути освещающего света в эталонном поле.Теперь доступны автоматические инструменты Lovibond, которые преодолевают субъективность визуальных методов. Система меню помогает оператору выбрать рабочие параметры. После этого измерения запускаются одним нажатием кнопки и занимают менее 25 с. Использование ячеек для образцов с длиной пути до 6 дюймов обеспечивает точное измерение цвета без увеличения ошибок даже для ненасыщенных образцов. В некоторых автоматических машинах для измерений используются шестнадцать интерференционных фильтров.

Визуальные колориметры просты, но медленны и утомительны в эксплуатации. Для увеличения скорости и воспроизводимости измерений были разработаны фотоэлектрические колориметры, которые измеряют цвета непосредственно в колориметрических величинах для одного источника света и наблюдателя (обычно источника света C и стандартного наблюдателя 2 °) с помощью широкополосных фильтров и фотоэлементов. Фотоэлектрический колориметр использует фототрубку или фотоэлемент, набор цветных фильтров, усилитель и индикаторный измеритель для количественного определения цвета.Принцип построения трехфильтрового фотоэлектрического колориметра показан на рис. 6.4. Свет, отраженный (или прошедший) от объекта, проходит через фильтры R, G, B последовательно из-за вращения диска, содержащего фильтр, и отдельно измеряется фотоэлектрическими детекторами фотонов. Результаты будут вводить в заблуждение, если только три фильтра не обеспечивают прямое считывание в терминах трехцветных значений CIE (см. Раздел 7.2) или аналогичных стандартных спецификаций и представляют три кривые отклика стандартного наблюдателя CIE.Этот тип колориметра также известен как трехцветный колориметр. Точно получить такой фильтр практически невозможно, но имеющихся фильтров может хватить для рутинной работы. Этот метод может быть бесполезным для метамерных пар, то есть идентичных по цвету при определенном освещении, но различающихся при рассмотрении под вторым источником света. Автоматический колориметр Lovibond сочетает в себе простоту визуальной системы номенклатуры и скорость и точность фотоэлектрического колориметра.

6.4.Фотоэлектрический трехцветный колориметр.

Масштабирование диагностики во время COVID-19: колориметрическая петлевая изотермическая амплификация (LAMP) с помощью напечатанного на 3D-принтере инкубатора для экономичного и масштабируемого обнаружения SARS-CoV-2

Введение

К концу На третьей неделе июня 2020 года во всем мире было официально зарегистрировано более 8,5 миллионов положительных случаев COVID-19 [1]. Даже развитые страны, такие как США, Англия, Франция и Германия, все еще пытаются смягчить распространение SARS-CoV-2, внедряя социальное дистанцирование и повсеместное тестирование.Менее развитые регионы, такие как Латинская Америка, Индия и Африка, сейчас переживают приход COVID-19, но этим территориям прискорбно не хватает финансов или установленной инфраструктуры для диагностики этой пандемической инфекции. Быстрое и массовое тестирование тысяч потенциально инфицированных субъектов было важным компонентом стратегии стран, которые эффективно предотвращают распространение COVID-19 среди своего населения (например, Китая [2], Южной Кореи [3] и Сингапура). [4]).Для сравнения: развивающиеся страны с высокой демографической плотностью, такие как Мексика [5], Индия [6] или Бразилия [7], могут быть не в состоянии создать достаточное количество централизованных лабораторий для быстрого широкомасштабного тестирования на COVID-19. .

В последнее время было предложено множество методологий для проведения экономически эффективной диагностики (например, те, которые основаны на иммуноанализе [8–11] или гибридизации конкретных генов с помощью систем CRISPR-Cas [12–14]). Хотя иммуноанализы являются точным и эффективным инструментом для оценки степени инфицирования для эпидемиологических исследований [15], их полезность ограничивается идентификацией инфицированных субъектов на ранних этапах инфекции [11,16], критическом периоде инфицированности.Например, экспериментальные данные, собранные у небольшого числа пациентов с COVID-19 (9 человек), показали, что 100% из них продуцировали специфические иммуноглобулины G (IgG) для SARS-CoV-2 в течение двух недель после заражения, но только 50% из них сделал это в течение первой недели после заражения [17].

Амплификация нуклеиновой кислоты продолжает оставаться золотым стандартом для выявления вирусных заболеваний на ранних стадиях [18–22], и очень небольшие вирусные нагрузки, присутствующие у симптомных или бессимптомных пациентов, могут быть надежно обнаружены с использованием методов, основанных на амплификации, таких как полимераза. цепная реакция (ПЦР) [23–25], амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) [26] и опосредованная петлей изотермическая амплификация (LAMP) [27–29].

Во время двух последних пандемических событий с гриппом A / h2N1 / 2009 и COVID-19 Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовали методы количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). как золотой стандарт официального выявления положительных случаев [16,30]. Однако использование RT-qPCR часто приводит к зависимости от централизованного лабораторного оборудования для тестирования [16,30–33]. Чтобы устранить этот недостаток, схемы изотермической реакции амплификации (т.е., LAMP и RPA) были предложены в качестве альтернативы основанным на ПЦР методам и устройствам для медицинских учреждений [32,34,35]. Актуальность использования надежных молекулярных методов медицинской помощи (POC) для массовой диагностики во время эпидемиологических чрезвычайных ситуаций стала еще более очевидной во время нынешних пандемий COVID-19 [30,36,37].

Во времена COVID-19 [38] ученые и филантропы по всему миру оперативно работали над разработкой быстрой и портативной диагностики SARS-CoV-2.В нескольких отчетах продемонстрировано использование колориметрических методов на основе LAMP для диагностики пандемии COVID-19 [39–44]. В некоторых из этих отчетов (в настоящее время доступных в виде препринтов) используется феноловый красный, хорошо известный индикатор pH, который помогает визуально различать положительные и отрицательные образцы [39,40,45].

В этом исследовании мы демонстрируем использование простого варианта колориметрического протокола LAMP для обнаружения и амплификации синтетических образцов и реальных образцов РНК от пациентов с SARS-CoV-2, причинным вирусным агентом COVID-D.В этой стратегии, основанной на LAMP, которой также способствует использование фенолового красного, инкубация образцов значительно упрощается за счет использования инкубатора с трехмерной (3D) печатью, подключенного к обычному циркулятору воды, в то время как различие между положительными и отрицательными образцами осуществляется достигается визуальным осмотром. Мы количественно анализируем различия в цвете между положительными и отрицательными образцами с использованием цветового разложения и анализа в цветовом пространстве CIELab [46]. Кроме того, мы сравниваем чувствительность этого колориметрического метода LAMP с протоколами ПЦР.Эта простая стратегия потенциально подходит для быстрого развертывания диагностических усилий в контексте пандемий COVID-19.

Обоснование

Мы разработали простой диагностический метод для обнаружения SARS-CoV-2, возбудителя COVID-19. Обоснование этой стратегии заключается в достижении максимально простой интеграции легкодоступных реагентов, материалов и технологий производства для облегчения быстрого и массового внедрения во время нынешних пандемий COVID-19 в регионах с низким или средним уровнем доходов.Этот метод основан на амплификации генетического материала SARS-CoV-2 с использованием LAMP. Амплификацию проводят с использованием коммерческой реакционной смеси в коммерческих и широко доступных 200 мкл пробирках для ПЦР Eppendorf. Кроме того, мы спроектировали и изготовили простую напечатанную на 3D-принтере камеру (рис. 1) для инкубации пробирок Эппендорфа и включения LAMP при высоких температурах (50–65 ° C) и в течение длительного времени (до 1 часа). Мы показываем, что эта инкубационная камера при подключении к обычному рециркулятору воды позволяет успешно амплифицировать положительные образцы (т.е.е., образцы, содержащие нуклеиновые кислоты SARS-CoV-2).

(A) Коммерческие 200-микролитровые пробирки Eppendorf для ПЦР и (B) напечатанный на 3D-принтере инкубатор использовался в экспериментах по амплификации образцов, содержащих синтетический материал нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2. (C) 3D CAD-модель реакционного инкубатора LAMP. (D) Фактическое изображение инкубатора трубки Eppendorf, подключенного к обычному циркулятору воды.

Эта инкубационная камера является одним из ключевых элементов, позволяющих быстро и повсеместно внедрить этот диагностический метод с низкими затратами.Этот напечатанный на 3D-принтере инкубатор можно быстро распечатать с помощью стандартных принтеров SLA, широко доступных на рынках по всему миру.

Можно использовать стандартные смолы для 3D-печати. Наличие исходных файлов AutoCAD (включенных сюда в качестве дополнительных материалов) позволяет быстро модифицировать / оптимизировать конструкцию для размещения большего количества образцов или больших или меньших пробирок, адаптации к любым доступным шлангам (трубкам) ​​и возможному включению он-лайн система считывания цветов.

Действительно, все это согласуется с основным обоснованием предлагаемой нами стратегии диагностики пандемии COVID-19: обеспечение быстрого и осуществимого ответа с использованием широко распространенных, распределенных и масштабируемых диагностических средств, созданных с использованием широко доступных ресурсов.

В следующем разделе мы кратко обсудим механизмы усиления и визуального различения положительных и отрицательных образцов.

Колориметрическая LAMP-амплификация

Присутствие фенолового красного в реакционной смеси LAMP позволяет невооруженным глазом различать положительные и отрицательные образцы (рис. 2). Реакционная смесь сочетается с изменением цвета pH фенолового красного, широко используемого индикатора pH, который меняет цвет от красного к желтому при pH 6.8. Во время LAMP-амплификации pH реакционной смеси непрерывно изменяется от нейтрального до кислотного по мере образования протонов [27,47]. Описан механизм образования ионов водорода (H ⁺ ) при амплификации в слабобуферных растворах [47]. ДНК-полимеразы включают дезоксинуклеозидтрифосфат в формирующуюся цепь ДНК. Во время этого химического события в качестве побочных продуктов выделяются пирофосфатный фрагмент и ион водорода (рис. 2А). Это высвобождение ионов водорода является количественным, в соответствии со схемой реакции, показанной на рисунке 2.Хвостовой участок H ⁺ высокий, так как он количественно пропорционален количеству вновь интегрированных dNTPs. Фактически, количественное производство H ⁺ является основой ранее описанных методов обнаружения, таких как технология полупроводникового секвенирования, работающая в секвенаторах Ion Torrent [48]. В исходно нейтральных и слабо забуференных реакционных смесях продукция H ⁺ во время амплификации LAMP постепенно и быстро сдвигает pH через пороговое значение фенолового красного (рис. 2B).

(A) Схема реакции LAMP. (B) Химическая структура фенолового красного. (C) Два разных набора праймеров LAMP были использованы для успешного нацеливания на последовательность гена, кодирующую белок SARS-Co2 N. Успешное нацеливание и амплификация ясно видны невооруженным глазом: положительные образцы меняют цвет с красного на желтый.

Более того, изменение pH ясно видно невооруженным глазом, тем самым освобождая пользователя от зависимости от спектрофотометрических инструментов и облегчая простоту реализации в чрезвычайных ситуациях (рис. 2C).Изображения на рисунке 2C показывают характерные цвета смесей для реакции амплификации, содержащихся в пробирках для ПЦР Eppendorf после инкубации в течение 30 мин. Были протестированы три различные температуры инкубации (50, 60 и 65 ° C), и были использованы два разных набора LAMP-праймеров (α и β) (Таблица 1).

Использовали два разных набора праймеров, направленных на последовательность РНК, кодирующую последовательность N SARS-CoV-2.

Оба набора грунтовок работали одинаково, по крайней мере на основании визуального осмотра, в трех испытанных температурных условиях.Различение положительных и отрицательных контролей возможно только невооруженным глазом, чтобы отличить продукты реакции от амплификаций, проводимых при 60 и 65 ° C. Отсутствие или незначительное усиление было обнаружено при 50 ° C или в контрольной группе.

Кроме того, мы смогли успешно различать положительные и отрицательные образцы, используя реакционную смесь LAMP, уже добавленную с праймерами и выдержанную при 20 ° C или 4 ° C в течение 24, 48, 72 и 96 часов (Рисунок S5). Стабильность реакции, изотермичность процесса амплификации и его независимость от специализированного оборудования значительно упрощают логистику внедрения этого метода диагностики за пределами централизованных лабораторий.

Анализ чувствительности

Мы провели серию экспериментов для оценки чувствительности реакций LAMP в инкубационной камере, напечатанной на 3D-принтере, с использованием двух наборов праймеров (α и β; Таблица 1). Амплификация проходит с достаточным качеством, чтобы также обеспечить надлежащую визуализацию продуктов амплификации в гелях для электрофореза даже при низких концентрациях нуклеиновых кислот. Мы наблюдали, что амплификация успешно прошла в широком диапазоне вирусных нагрузок, от 625 до 5 × 10 ⁵ копий в экспериментах с использованием синтетического материала нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 (рис. 3A).Мы четко наблюдали амплификацию в образцах, содержащих всего 625 копий вируса, после 50 мин инкубации при 65 ° C. Если мы поместим этот диапазон в надлежащий клинический контекст, фактическая вирусная нагрузка COVID-19 в мазках из носа у пациентов, по оценкам, находится в диапазоне от 10 ⁵ до 10 ⁶ вирусных копий на мл [49]. Различие между положительными и отрицательными образцами (контролями) можно четко установить невооруженным глазом во всех реакциях, инкубированных в течение 50 минут, независимо от количества присутствующих копий вируса.Кроме того, мы не наблюдали какой-либо неспецифической амплификации в отрицательных образцах (т.е. содержащих синтетический генетический материал из EBOV), инкубированных в течение 50 минут при 65 ° C. Действительно, идентификация и амплификация синтетического материала SARS-CoV-2 возможна в образцах, содержащих ~ 62,5 вирусных копии, с использованием этой стратегии LAMP (рисунок S3) и времени инкубации 50–60 минут.

(A) Наборы праймеров LAMP α и β позволяют амплифицировать синтетические образцы нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 в широком диапазоне концентраций матрицы, от 625 до 2,0 × 10 ⁵ копий ДНК SARS-CoV-2 при инкубации в течение 50 минут в диапазоне температур от 60 до 65 ° C. (B, C) Электрофорез в агарозном геле продуктов амплификации ДНК, полученных путем нацеливания на две разные области последовательности, кодирующей белок SARS-Co2 N. Использовали два разных набора праймеров: (B) набор праймеров α и (C) набор праймеров β.Исходное количество матрицы постепенно уменьшалось слева направо: 2,0 × 10 ⁵ копий ДНК (дорожка 1), 4,0 × 10 ⁴ копий, (дорожка 2), 1,0 × 10 ⁴ копий (дорожка 3), 2,5 × 10 ³ копий (дорожка 4), 625 копий (дорожка 5), отрицательный контроль (дорожка 6) и лестница молекулярной массы (дорожка 7). Панели B и C соответствуют частям полноразмерных гелей, представленных на дополнительных фигурах S8A и S8B, соответственно.

Мы подтвердили амплификацию путем визуализации продуктов LAMP с помощью гель-электрофореза для различных протестированных вирусных нагрузок.На рисунках 3B, C показаны агарозные гели продуктов амплификации каждого из экспериментов с LAMP, где для амплификации одного и того же диапазона концентраций матрицы использовались два разных набора праймеров (α и β) (от 625 до 2 × 10 ^5). синтетических вирусных копий). Нам удалось создать видимый массив полос продуктов амплификации, типичную сигнатуру LAMP, для обоих наборов праймеров LAMP и для всего диапазона синтетических вирусных нагрузок. Действительно, оба набора праймеров давали сходные профили амплификации.

Таким образом, используя праймеры и методы, описанные здесь, мы смогли последовательно обнаружить присутствие синтетических нуклеиновых кислот SARS-CoV-2. Мы использовали простой напечатанный на 3D-принтере инкубатор, подключенный к циркулятору воды, для проведения LAMP. Мы показываем, что всего после 30 минут инкубации образцы, содержащие вирусную нагрузку в диапазоне от 10 ⁴ до 10 ⁵ копий, можно было четко отличить от отрицательных образцов при визуальном осмотре невооруженным глазом (рис. 2C). Образцы с более низкой вирусной нагрузкой были четко различимы при инкубации LAMP-реакции в течение 50 мин.Инкубационные периоды до 1 часа при 68 ° C не вызывали ложноположительных результатов и позволили амплифицировать всего около 62 копий синтетического генетического материала SARS-CoV-2. Эти результаты согласуются с результатами других отчетов, в которых колориметрическая LAMP с помощью фенолового красного использовалась для усиления генетического материала SARS-COV-2 [39,40]. Мы наблюдаем 0 ложноположительных случаев в экспериментах, где синтетические образцы, содержащие генетический материал EBOV, инкубировали при 65 ° C в течение 1 часа.

В текущем контексте пандемии COVID-19 важность сообщения об этом результате заключается не в его новизне, а в его практичности.Ниже приводятся некоторые соображения относительно стоимости. В то время как рыночная стоимость традиционного аппарата RT-qPCR (текущий золотой стандарт диагностики COVID-19) находится в диапазоне от 10 000 до 40 000 долларов США, инкубатор, напечатанный на 3D-принтере, такой как описанный здесь (Рисунок S1, S2; Дополнительный файл S1) можно было изготовить менее чем за 200 долларов США в любом магазине 3D-принтеров. Эта разница значительна, особенно во время эпидемии или пандемического кризиса, когда рациональное инвестирование ресурсов имеет решающее значение. В то время как количественные возможности тестирования с использованием платформы RT-qPCR неоспоримы, способность многих стран быстро, эффективно и массово создавать диагностические центры на основе RT-qPCR сомнительна.Текущие сценарии пандемии, испытанные, среди прочего, в США, Италии, Франции и Испании, грубо продемонстрировали, что централизованные лаборатории не являются идеальным решением во время чрезвычайных ситуаций. Портативные диагностические системы могут обеспечить жизненно важную гибкость и скорость реакции, которые платформы RT-qPCR не могут обеспечить.

Возможность количественной оценки в реальном времени

Здесь мы дополнительно проиллюстрируем детерминированную и количественную зависимость между концентрацией продукта амплификации и цветным сигналом, производимым во время этой колориметрической LAMP-реакции.С этой целью мы смоделировали эксперименты по амплификации в реальном времени, проведя серию реакций амплификации с использованием начальных количеств 625, 1 × 10 ⁴ и 2 × 10 ⁵ копий синтетического генетического материала SARS-CoV-2 в нашем Инкубатор, напечатанный на 3D-принтере.

Мы извлекали образцы из инкубатора через 0, 10, 20, 30, 40 и 50 минут инкубации при 65 ° C. Цвет этих образцов был задокументирован как изображения, снятые с помощью смартфона (iPhone 7) на белом фоне (рис. 4A).Изображения были проанализированы с помощью бесплатного приложения Color Companion ^® для iPhone или iPad. Вкратце, цветные изображения были разложены на компоненты пространства CIELab. В цветовом пространстве CIELab каждый цвет может быть представлен как точка в трехмерном пространстве, определяемом значениями L, a и b [46]. В этой системе координат L — это светимость (от 0 до +100), a — сине-желтая ось (от -50 до 50) и b — зелено-красная ось. (который колеблется от — 50 до 50) (Рисунок S4).

Оценка чувствительности комбинированного использования колориметрического метода LAMP с использованием фенолового красного. (A) Испытания на чувствительность с использованием различных концентраций матрицы (положительный контроль) и двух разных наборов праймеров: α (указано синим) и β (указано красным). Фотографии пробирок для ПЦР Eppendorf, содержащих положительные образцы и отрицательные контроли, были получены с помощью смартфона. (C, D) Расстояние в цветовом пространстве CIELab между отрицательными контролями (красный) и образцами, содержащими различные концентрации материала нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 (т.е.е., 625, 10000 и 200000 синтетических копий) проанализированы после разного времени инкубации (т.е. 10, 20, 30, 40 и 50 минут) при 65 ° C. Анализ цветовых расстояний представлен для амплификаций, проведенных с использованием набора праймеров (B) α и (C) β.

Разницу между двумя цветами можно количественно представить как расстояние между двумя точками, которые эти цвета представляют в системе координат CIELab. Для колориметрической реакционной смеси LAMP, используемой в наших экспериментах, спектр возможных цветов изменяется от красного (для отрицательных контролей и отрицательных образцов) до желтого (для положительных образцов).Удобно, что полный диапазон цветов для образцов и контролей может быть представлен в красном и желтом квадранте, определяемом L [0,100], a [0,50] и b [0,50]. Например, разница между цветом образца (в любой момент реакции) и цветом отрицательного контроля (красный; L = 53,72 ± 0,581, a = 38,86 ± 2,916 и b = 11,86 ± 0,961) может быть рассчитывается в пространстве CIELab. Мы определили расстояние в пространстве CIELab между цветом образцов, взятых в разное время инкубации, которые содержали генетический материал SARS-CoV-2, и отрицательные контроли (рис. 4B, C).Мы повторили этот расчет для каждого из наборов праймеров LAMP, которые мы использовали, а именно для набора праймеров α (рис. 4B) и β (рис. 4C). Эти результаты предполагают, что разница в цвете между образцами и отрицательными контролями поддается количественной оценке. Следовательно, может быть реализован цветовой анализ, чтобы помочь различать положительные и отрицательные стороны. Кроме того, методы визуализации и анализа цвета могут быть реализованы в этой простой стратегии колориметрической диагностики LAMP для визуализации количественной лампы в реальном времени (RT-qLAMP).

В качестве альтернативы, прогресс амплификации в разное время можно контролировать, добавляя интеркалирующий ДНК-агент (например, краситель EvaGreen) и измеряя флуоресценцию во времени (рис. S5).

Обратите внимание, что коэффициенты дисперсии для контроля составляют 1,08, 7,50 и 8,10% для L, a и b соответственно. Эти небольшие значения предполагают надежность и воспроизводимость местоположения координат контрольной точки (контрольной точки). Точно так же изменение цвета между отрицательными контролями и положительными образцами, инкубированными в течение 50 минут, было воспроизводимым и устойчивым (в среднем 46.60 +/- 4,02 д.е.; коэффициент дисперсии 8,62%).

Интересно, что мы наблюдали значительные различия в производительности двух наборов праймеров LAMP, используемых в экспериментах, описанных здесь (рисунки 4B и 5). Наши результаты показывают, что набор праймеров α обеспечивал более быструю амплификацию в образцах с меньшим количеством вирусных копий. Соответственно, этот набор праймеров давал положительную дискриминацию в образцах с 625 вирусными копиями за 30 мин (рис. 4В). Использование набора праймеров β позволило получить аналогичные различия в цвете, измеренные как расстояния в 3D-пространстве CIELab, за 40 мин (рис. 4C).

Изменение во времени расстояния в цвете относительно отрицательных контролей (красный цвет) в пространстве CIELab для положительных образцов SARS-CoV-2, содержащих 625 (светло-синий, ▪), 1 × 10 ⁴ (средний синий, ▪) и 2,5 × 10 ⁶ (темно-синий, ▪) копий синтетических нуклеиновых кислот SARS-CoV-2. Результаты, полученные в экспериментах с использованием (A) набора праймеров α и (B) набора праймеров β. (C) Сравнение производительности ПЦР и LAMP в смоделированном эксперименте в реальном времени. Развитие сигнала флуоресценции, измеренное на планшет-ридере, в экспериментах ПЦР (черные кружки) и LAMP (красные квадраты).На вставке показано увеличение экспоненциальной стадии процесса усиления.

Эти данные позволяют предположить, что набор праймеров α должен быть предпочтительным для конечной реализации этого колориметрического метода LAMP. Интересно, что набор праймеров β может лучше служить целям реализации в реальном времени. В то время как набор праймеров α вызывал аналогичные траектории изменения цвета в образцах, содержащих 1,0 × 10 ⁴ и 2,0 × 10 ⁵ копий вируса (рис. 5A), набор праймеров β лучше позволял различать амплификации, полученные из различных исходных вирусных нагрузок. (Рисунок 5B).

Сравнение LAMP и ПЦР

LAMP считалось ранее более эффективной реакцией амплификации, чем ПЦР, поскольку за единицу времени продуцируется больше ДНК из-за использования большего количества праймеров [50] (в данном случае 6 против 2). Чтобы завершить наш анализ, мы смоделировали некоторые эксперименты по амплификации в реальном времени, чтобы сравнить эффективность LAMP и ПЦР в аналогичных условиях (рис. 6A). С этой целью мы провели реакции амплификации с использованием начальных количеств 4 × 10 ⁴ копий синтетического SARS-CoV2 в коммерческом цикле мини-ПЦР [24,51] (с использованием набора праймеров N1) и в нашем инкубаторе, напечатанном на 3D-принтере LAMP (с использованием набор праймеров β).Мы добавили интеркалирующий агент, краситель EvaGreen ^® , в реакционную смесь в начальный момент времени и экстрагировали образцы через 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 и 51 минуту. Эти образцы из экспериментов ПЦР и LAMP распределяли в 96-луночные планшеты. Затем флуоресценцию этих образцов измеряли в коммерческом планшет-ридере [24] (рис. 5C). Мы наблюдали экспоненциальное увеличение флуоресценции по мере выполнения большего количества циклов LAMP или ПЦР, что подчеркивает количественный характер реакции интеркалирования.Реакция LAMP дает значительно более высокие сигналы флуоресценции, чем реакция ПЦР в течение всего времени реакции. Разница между флуоресцентным излучением обеих амплификаций более очевидна после первых 20 минут амплификации. Эти результаты также предполагают, что использование коммерческого планшет-ридера для определения степени продвижения LAMP-амплификаций является практичной и надежной альтернативой использованию колориметрических оценок. Более того, считывание флуоресценции продуктов LAMP может привести к точному количественному определению вирусной нагрузки SARS-CoV-2.

Прогрессирование изменения цвета во время амплификации в реальных экстрактах РНК от пациентов. (A) Экстракты РНК из образцов COVID-19 (+) и COVID-19 (-), амплифицированные колориметрической LAMP, можно легко различить при визуальном осмотре. (B) Продукты амплификации LAMP из РНК (дорожки 1 и 2) и экстрактов РНК (дорожки 3 и 4) от пациента с COVID (+) и добровольца с COVID (-) (дорожка 5), как показали эксперименты с гель-электрофорезом. Лестница молекулярной массы показана на дорожке 6. Панель B соответствует части геля полной длины, представленной на дополнительных фигурах (рисунок S9).(C) Динамика изменения цвета в реакционных смесях LAMP, содержащих 300 нг экстракта РНК от COVID (-) добровольца (по данным RT-qPCR) и 3, 30 и 300 нг экстракта РНК из COVID (+ ) пациента (по диагнозу RT-qPCR). (D) Цветовое расстояние относительно отрицательных контролей (красный цвет) в пространстве CIELab для экстрактов РНК от добровольца COVID (-) (по данным RT-qPCR), содержащих 300 нг нуклеиновых кислот, и COVID (+) пациент (диагностированный методом RT-qPCR), содержащий 3, 30 и 35 (темно-синий, ▪) нг нуклеиновых кислот.Отображаются показания на 0, 30 и 60 минутах. Предлагаемое положительное – отрицательное пороговое значение обозначено красной линией. (E) Изменение во времени расстояния по цвету относительно отрицательных контролей (красный цвет) в пространстве CIELab для экстрактов РНК от добровольца COVID (-) (как диагностировано с помощью RT-qPCR), содержащих 300 нг нуклеиновых кислот (красный, ▪), а также от пациента с COVID (+) (согласно диагнозу RT-qPCR), содержащего 3 (светло-синий, ▪), 30 (средне-синий, ▪) и 35 (темно-синий, ▪) нг нуклеиновых кислот. Предлагаемое положительное – отрицательное пороговое значение обозначено красной линией.

Мы также сравнили эффективность RT-qPCR и колориметрической LAMP с использованием реальных экстрактов РНК, выделенных от людей-добровольцев. Для этого сначала мы использовали колориметрическую LAMP для диагностики одного образца РНК, подтвержденного как положительный на COVID-19, и другого, подтвержденного как отрицательный, согласно результатам RT-qPCR. Экстракты РНК от пациента с COVID-19 (+) были четко отделены от экстрактов пациентов с COVID-19 (-) с помощью наших колориметрических амплификаций LAMP (рисунок 6A).

Аналогичные результаты были получены независимо от используемого набора праймеров LAMP (т.е.е., α и β). Мы подтвердили наши результаты амплификации LAMP с помощью стандартного гель-электрофореза (рис. 6B). Кроме того, образцы были серийно разбавлены для проверки чувствительности колориметрической LAMP. Мы смогли различить положительные и отрицательные образцы во всем протестированном диапазоне концентраций (300 нг общей РНК, как определено с помощью анализа nanoDrop). Сдвиг цвета (от красного к желтому) отчетливо ощущался после 30 минут амплификации в образцах, содержащих 300 нг общей РНК от пациентов с COVID (+).Образцы, содержащие 30 и 3 нг общей РНК, требовали более длительного времени (рис. 6С).

Положительные образцы показали изменение цвета после 60 минут амплификации, в то время как отрицательные образцы не изменились. Мы количественно оценили изменение цвета в положительных и отрицательных образцах, используя анализ цветного изображения и вычислив цветовые расстояния в цветовом пространстве CieLab (рис. 6D, E).

Наши эксперименты показывают, что цветовая разница между положительными и отрицательными образцами РНК от людей-добровольцев пропорциональна количеству вирусных копий.Эти результаты предполагают, что изменение цвета может быть количественно связано с вирусной нагрузкой SARS-CoV-2 в реальных экстрактах РНК, как и в синтетических образцах.

В последней серии экспериментов мы вслепую протестировали набор из 8 экстрактов человеческой РНК из образцов носоглотки, соответствующих 2 пациентам с диагнозом COVID-19 (-) и 6 пациентам с диагнозом COVID-19 (+) RT. -qPCR. Мы доводили содержание РНК во всех образцах до 300 нг / мкл РНК, а затем разбавляли их, чтобы получить образцы, содержащие 30 нг / мкл.Все образцы, неразбавленные и разбавленные, добавляли реактивной смесью LAMP и инкубировали при 65 ° C в течение 50 минут. Все образцы имеют красный цвет перед инкубацией (рис. 7A), и только положительные образцы меняют цвет на желтый во время инкубации (рис. 7B). Мы подтвердили результаты гель-электрофорезом продуктов амплификации. Только положительные образцы показали характерный профиль ДНК, связанный с продуктами LAMP (рис. 7C, D). Колориметрический LAMP также смог правильно различать положительные образцы даже в разбавленных экстрактах, содержащих на порядок меньше РНК, чем в исходных экстрактах.Положительные образцы РНК COVID-19, исходные или разбавленные, показали аналогичные значения расстояния по цвету по сравнению с отрицательными образцами, хотя стандартные отклонения были выше в образцах, содержащих 30 нг / мкл, чем в образцах, содержащих 30 нг / мкл (рис. 7E). .

Различение реальных экстрактов РНК из положительных и отрицательных образцов COVID-19. Цвет экстрактов РНК из 6 образцов COVID-19 (+) и 2 COVID-19 (-) в двух разных концентрациях (300 и 30 нг / мкл) (A) до и (B) после колориметрической LAMP-реакции.Образцы вируса COVID-19 (S1, S2, S3. S4. S6 и S8) можно легко отличить при визуальном осмотре. (C) Расстояние в цвете образцов экстрактов РНК по отношению к отрицательным образцам (S5 и S7) в пространстве CIELab. Представлены расстояния в цвете образцов, содержащих 300 нг нуклеиновых кислот (оранжевые полосы) или 30 нг нуклеиновых кислот (желтые полосы). (DE) Продукты амплификации LAMP из экстрактов РНК, содержащих (D) 300 нг / мкл и (E) 30 нг / мкл, от той же группы пациентов с COVID (+) (S1-S4, S6 и S8) и COVID (-) добровольцы (S5 и S7), как показали эксперименты с гель-электрофорезом.Дорожки с 1 по 8 содержали продукты амплификации от образцов S1 до S8. Дорожка 9 была зарезервирована для лестницы молекулярной массы. Панели D и E соответствуют частям полноразмерных гелей, представленных на дополнительных фигурах S10A и S10B, соответственно.

В этом сокращенном наборе экстрактов из образцов носоглоточных пациентов диагностические результаты колориметрической LAMP полностью соответствовали результатам RT-qPCR.

Более того, различение положительных образцов даже в разбавленных образцах предполагает, что этот колориметрический метод может быть полезен даже в ситуациях, когда количество экстрагированной РНК невелико из-за неправильного отбора / экстракции или деградации во время транспортировки.

Заключительные замечания

Проблема обнаружения вирусных угроз на месте оказания помощи имеет первостепенное значение, особенно в слаборазвитых регионах и в чрезвычайных ситуациях (например, при эпидемиях). В контексте текущей пандемии COVID-19 доступность инфраструктуры тестирования на основе RT-qPCR признана серьезной проблемой во всем мире. В развивающихся странах (например, в Латинской Америке, Индии и большинстве стран Африки) имеющихся в настоящее время ресурсов для массового тестирования COVID-19 методом RT-qPCR явно будет недостаточно.Даже в развитых странах время получения диагностических результатов ОТ-КПЦР с помощью теста ОТ-КПЦР на COVID-19 в настоящее время составляет от 1 до 5 дней.

Очевидно, что имеющиеся ПЦР-лаборатории перегружены образцами, у них слишком мало персонала для проведения тестов, они борются с задержками по приборам и сталкиваются со сложной логистикой для транспортировки хрупких и инфекционных образцов при сохранении холодовой цепи.

Здесь мы продемонстрировали, что простой вариант реакции LAMP с использованием фенолового красного в качестве индикатора pH и использования простой 3D-печатной камеры, подключенной к циркуляционному насосу, может обеспечить быструю и высокоточную идентификацию. образцов, содержащих искусственные генетические последовательности SARS-CoV-2.Мы также показали, используя синтетический SARS-CoV-2 и ограниченное количество экстрактов РНК от пациентов, что колориметрический LAMP является количественным методом, сравнимым с RT-qPCR. Амплификация очевидна визуально, без необходимости в каких-либо дополнительных инструментах, даже при низком количестве вирусных копий. В наших экспериментах с синтетическими образцами мы наблюдали 100% точность в образцах, содержащих всего 625 копий генетического материала SARS-CoV-2.

Подтверждение этих результатов с использованием большего количества реальных образцов человека от положительных и отрицательных субъектов COVID-19, очевидно, необходимо для получения полной оценки потенциала этой стратегии как альтернативы платформам RT-qPCR.Однако наши результаты с синтетическими образцами и с уменьшенным количеством образцов, содержащих РНК от людей-добровольцев (8 образцов), предполагают, что эта простая стратегия может значительно расширить возможности тестирования COVID-19 в ситуациях, когда ОТ-КПЦР неосуществима или недоступна. . Недавно другие группы показали, что точное различие между положительными и отрицательными образцами COVID-19 является положительным в реализациях RT-qPCR без экстракции [52] и колориметрических LAMP [45]. Смырлаки и др. всесторонне исследовали эффективность протокола RT-qPCR без экстракции, в котором образцы слюны или носоглотки нагревали при 95 ° C в течение 5 минут для инактивации вируса, а затем непосредственно амплифицировали.Lalli et al. продемонстрировали успешную амплификацию с использованием аналогичного колориметрического протокола LAMP, в котором они нагревали образцы слюны при 50 или 64 ° C в течение 5 минут, необязательно добавляя протеазу K. Эти результаты предполагают, что безэкстракционные реализации методов амплификации, включая колориметрическую LAMP, могут успешно идентифицировать COVID- 19 положительных пациентов из носоглотки и образцов слюны. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что колориметрическая LAMP без экстракции обеспечивает средства для рентабельной массовой диагностики SARS-CoV-2 и является многообещающим инструментом для борьбы с пандемией, который заслуживает дальнейшего изучения.

Дополнительная информация

Рисунок S1. (A) Фотография и (B) визуализация инкубационной камеры, напечатанной на 3D-принтере, используемой в экспериментах с LAMP.

Рисунок S2. Схематическое изображение камеры (разные виды) с указанием ее соответствующих размеров.

Рисунок S3. Коммерческая плазмида, содержащая плазмиды, содержащие полный ген N из 2019-nCoV, SARS и MERS. Мы используем эту плазмиду в качестве синтетического материала нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 в наших экспериментах по амплификации.

Рисунок S4. In house сконструировали плазмиду, содержащую ген, кодирующий экспрессию белка GP из EBOV. Эта плазмида была добавлена ​​в качестве материала нуклеиновой кислоты в отрицательный контроль в наших экспериментах по амплификации.

Рисунок S5. (A) Колориметрический метод LAMP, описанный здесь, позволил идентифицировать и амплифицировать синтетический генетический материал SARS-CoV-2 в образцах, содержащих всего около 62 вирусных копий. (B) Оценка стабильности и функциональности реакционной смеси LAMP при различных временах хранения и температурах.Реакционная смесь, в состав которой входят праймеры LAMP и готовая к добавлению экстрактов нуклеиновых кислот, является функциональной и позволяет различать положительные и отрицательные образцы при хранении (i) при комнатной температуре в течение 48 часов или (ii) при 4 ° C в течение 72 часов. час

Рисунок S6. (A) Цветовой анализ, проведенный на положительных и отрицательных образцах SARS-CoV-2, содержащихся в пробирках для ПЦР Eppendorf (желтая вставка), с использованием приложения Apple Color Companion (загружаемого в Apple Store, США). Это приложение определяет компоненты цвета в определенном месте изображения (черный кружок на желтой вставке) в пространствах CIELab, RGB, HSB или CMYK.Изображение можно загрузить с помощью электронной почты, аирдропа или WhatsApp. (B) Схематическое изображение пространства CIELab, цветовой системы, в которой любой цвет может быть представлен в виде точки и ее координат в трехмерном пространстве, где L — яркость, a — ось между зеленым и красным, а b — ось между желтым и красным.

Рисунок S7. (A) Количество продукта амплификации в экспериментах с LAMP оценивали путем измерения флуоресценции, испускаемой продуктом амплификации в реакциях с добавленным интеркалирующим агентом.Считывание флуоресценции проводили в стандартных 96-луночных планшетах с использованием обычного планшет-ридера. (A) Показания флуоресценции, измеренные коммерческим планшет-ридером, для различных разведений синтетических ДНК-матриц SARS-CoV-2. Показаны результаты с использованием двух различных наборов праймеров LAMP: набор α (обозначен синим) и набор β (обозначен красным).

Рисунок S8. Изображения гелей полной длины, из которых были получены Фигуры 3B и 3C. (A, B) Электрофорез в агарозном геле продуктов амплификации ДНК, полученных путем нацеливания на две разные области последовательности, кодирующей белок SARS-Co2 N.Использовали два разных набора праймеров: (B) набор праймеров α и (C) β. Исходное количество матрицы постепенно уменьшалось слева направо: 2,0 × 105 копий ДНК (дорожка 1), 4,0 × 104 копий, (дорожка 2), 1,0 × 104 копий (дорожка 3), 2,5 × 103 копий (дорожка 4), 625 копий (дорожка 5), отрицательный контроль (дорожка 6) и лестница молекулярной массы (дорожка 7).

Рисунок S9. Изображение геля во всю длину, из которого была получена фигура 6В. Продукты амплификации LAMP из экстрактов РНК (дорожки 1 и 2) и кДНК (дорожки 3 и 4) от пациента с COVID (+) и добровольца с COVID (-) (дорожка 5), как показали эксперименты с гель-электрофорезом.Лестница молекулярной массы показана на дорожке 6.

Рисунок S10. Изображение гелей полной длины, из которых были получены Фигуры 7D и 7E. (AB) Продукты амплификации LAMP из экстрактов РНК, содержащих (D) 300 нг / мкл и (E) 30 нг / мкл, от той же группы пациентов с COVID (+) (S1-S4, S6 и S8) и COVID (-) добровольцы (S5 и S7), как показали эксперименты с гель-электрофорезом. Дорожки с 1 по 8 содержали продукты амплификации от образцов S1 до S8. Дорожка 9 была зарезервирована для лестницы молекулярной массы.

Интеллектуальные неколориметрические индикаторы для цепочки поставок скоропортящихся нетканых материалов с фотопрограммируемым тепловым откликом

Электропрядение и фотопрограммирование органических нетканых материалов

Шаги фотопрограммирования индикаторов показаны на схеме Рис. 1а. Однородные и гладкие волокна электроспрядены из SU-8 3025, отрицательного эпоксидного резиста, широко используемого в оптической и электронно-лучевой литографии, путем правильного выбора параметров прядения (рис.S1 и S2 в дополнительной информации). По сравнению с другими органическими соединениями, SU-8 демонстрирует высокий показатель преломления (~ 1,59 в видимом спектральном диапазоне), что мотивировало его использование в прошлом в волноводах, содержащих квантовые точки ¹⁸ . В рамках настоящей работы это свойство имеет значение для обеспечения поверхностей, покрытых неткаными материалами SU-8, с замечательной диффузной отражательной способностью, как более подробно объясняется ниже. Спряденные органические волокна нестабильны с течением времени, плавление наблюдается в течение 30 минут даже при комнатной температуре, как показано на рис.S3 и S4. Следовательно, в нашем процессе нетканый материал изначально стабилизируется с помощью первого этапа фотопрограммирования, который выполняется вскоре после формования, чтобы способствовать сшиванию SU-8 калиброванной дозой УФ-облучения (<100 мДж / см ² ) на всех участках. поверхности (верхняя правая часть рис. 1а). Затем выполняется второй этап фотопрограммирования, который является пространственно селективным, то есть дальнейшее УФ-облучение выполняется на части ткани через оптическую маску (нижняя правая часть рис. 1а). Две последовательные подсветки дополняют друг друга в определении свойств и последующей эволюции запрограммированного индикатора, поскольку первая из них кодирует общее температурно-временное поведение системы посредством ее теплового отклика, а вторая обеспечивает дополнительную дозу для разработки заранее заданного, неколориметрический конечный визуальный результат.

a Схематическое изображение фотопрограммирования индикатора. Нанесение и фотопрограммирование волокнистого нетканого материала СУ-8 (синие вертикальные лучи) при калиброванной оптической дозе и активации рисунка. Предупреждающий знак появится, когда полученный впоследствии температурно-временной профиль превосходит целевые запрограммированные значения (т. Е. Правильные условия хранения предметов) за счет контраста диффузного отражения (зеленые лучи). b Рассчитанные средние значения степени сшивки Γ при различных дозах облучения во время фотопрограммирования (левая вертикальная шкала).Данные усредняются по крайней мере по трем образцам для каждой дозы (планка погрешностей: стандартное отклонение). Также отображаются точки перегиба DSC ( T _g , правая вертикальная шкала) для нетканых материалов после первого шага фотопрограммирования при различных дозах УФ-излучения. Синяя линия соответствует экспериментальным данным (ромбы). T _g0 и T _g80 относятся к образцам, фотопрограммируемым (шаг 1) с УФ-дозами: 0 и 80 мДж / см ² , соответственно. c Изменение оптического пропускания (точки, ΔTr) при λ = 510 нм в зависимости от температуры для ткани с первым этапом фотопрограммирования при 80 мДж / см ² . Пунктирная линия — ориентир для глаза. Врезка: нормализованные спектры Tr _{t 0} (черная линия, левая вертикальная шкала) и R _{t 0} (синяя линия, правая вертикальная шкала). Tr _{t 0} и R _{t 0} — оптическое пропускание и коэффициент диффузного отражения, измеренные при t ₀ = 0, соответственно. R _{t 0} измеряли с помощью интегрирующей сферы (см. Методы). d Временное изменение ΔTr (при λ = 510 нм, вертикальная шкала слева) для образцов, хранящихся при T _окр. (~ 20 ° C, розовые точки), 25 ° C (зеленые точки), 30 ° C (красные точки) и 35 ° C (черные точки). Соответствующее изменение оптического отражения Δ R (при 510 нм, пустые точки, правая шкала) в зависимости от времени также показано для образцов при 35 ° C. Пунктирные линии — ориентиры для глаз.

В фотоотверждаемых термореактивных смолах полное затвердевание, вызванное светоактивированной катионной полимеризацией, обычно происходит во время постэкспозиционного обжига, значительно превышающего температуру стеклования, T _г (~ 50 ° C в неотвержденных пленках SU-8). Ожидается, что очень мало реакций будет происходить ниже температуры стеклования из-за в значительной степени ограниченных молекулярных движений ¹⁹ . Вместо этого, в отличие от обычных литографических процессов, здесь не выполняется выпечка после экспонирования, чтобы способствовать сшиванию смолы в очень тонких органических волокнах.На степень сшивки материала могут влиять различные механизмы, включая быструю динамику границы раздела, влияющую на совместное движение мономеров ²⁰ , локальные ограничения цепи ²¹ и фототермические эффекты, вызванные поглощением света ^{22 , 23} . С целью более глубокого изучения этого поведения мы анализируем нетканые материалы SU-8 до и после экспонирования с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) и дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), демонстрируя корреляцию свойств материала с дозой облучения. изображенный на рис.1b. Спектры FTIR (рис. S5) показывают пики, соответствующие модам удлинения C – O эпоксидных групп (при 862 и 911 см, ^-1 ), интенсивность которых уменьшается при сшивании SU-8 и достигает пиков при 1508 и 1607 см ^-1 , что соответствует модам C – C растяжения ароматического кольца, чьи интенсивности не меняются в процессе полимеризации ^24,25 . Значения поглощения пиков при 911 и 1607 см ^-1 можно использовать для оценки степени полимеризации при УФ-облучении (рис.1b) через выражение Γ = 1 — [( A _E / A _R ) / ( A _{E 0} / A _{R 0} )], где A _E ( A _{E 0} ) и A _R ( A _{R 0} ) пик при 911 см ⁻¹ и опорный пик при 1607 см ⁻¹ , до ( A _{E 0} , A _{R 0} ) и после ( A _E , A _R ) экспозиции соответственно ^26,27 .Было обнаружено, что Γ увеличивается до максимума примерно на 10% при увеличении дозы облучения на первом этапе фотопрограммирования (0–80 мДж / см ² ), подчеркивая, что точный контроль достижим для степени сшивки нетканый материал и, как следствие, температурно-временной отклик устройства. Для нетканого материала, полученного формованием, температура стеклования ( T _g0 на рис. 1b) составляет 13 ° C (рис. S6), то есть ниже комнатной температуры, что согласуется с низкой стабильностью и поведение плавления, наблюдаемое в неэкспонированных волокнах.Значение T _g перемещается к более высоким температурам (рис. S6), примерно линейно увеличиваясь при УФ-облучении при низкой дозе, со скоростью примерно 0,1 ° C × см ² / мДж (рис. 1b). Кроме того, стоит отметить, что дозы УФ, используемые здесь на первом этапе фотопрограммирования, намного ниже тех, которые обычно используются в литографических процессах на резисте (150–250 мДж / см ² ) ²⁸ , что делает на втором этапе материал все еще реагирует на УФ-излучение. Действительно, Γ дополнительно удваивается после второго этапа фотопрограммирования (> 200 мДж / см ² ), подчеркивая заметно увеличенное поперечное сшивание (рис.1б).

Из-за различной степени сшивки мы обнаружили, что каждый запрограммированный нетканый материал очень чувствителен к определенной рабочей температуре, T _w , с точки зрения его оптических (светорассеивающих) свойств. Этот аспект проиллюстрирован на рис. 1c, где мы показываем, как оптическое пропускание Tr, измеренное при длине волны падающего света ( λ ) 510 нм для нетканых материалов, экспонированных с помощью 80 мДж / см ² ( T _w ≅ 38 ° C), изменяется при нагревании при разных температурах.Здесь ΔTr определяется как Tr — Tr _{t 0} , где Tr измеряется при выдерживании образцов при каждой заданной температуре в течение 60 минут, а Tr _{t 0} — коэффициент пропускания при t ₀ = 0, т.е. сразу после фотопрограммирования. Данные показывают почти стабильное оптическое пропускание до 30 ° C (ΔTr ~ 0,6%) с последующим быстрым увеличением прозрачности системы для температур в интервале 30–45 ° C (ΔTr ~ 80%) и новым условием плато (ΔTr ~ 90%) выше 45 ° C.Такое поведение связано с быстрым увеличением подвижности и образованием вязкого течения после распутывания цепей в волокнистом материале, чему способствует нагревание. Аналогичный механизм был недавно использован с самовосстанавливающимися термопластичными полиуретанами ¹⁷ . Соответствующие спектры пропускания и диффузного (полусферического) отражения ( R ) для материала после формования ( t = 0) показаны на вставке к рис. 1c, выделяя независимое от длины волны (белое) поведение в диапазоне 400–700 нм, что делает систему оптимальной для работы с окружающим освещением (рис.S7). Дополнительно проводятся долгосрочные эксперименты, поддерживая систему при постоянной температуре, такой как 20, 25, 30 и 35 ° C до 25 дней (рис. 1d). Материал стабилен при T ≤ 25 ° C, при этом не обнаружено значительных изменений пропускания, что устанавливает верхний предел для температуры хранения до использования этой конкретной системы. Вместо этого, замечательный отклик в долгосрочной перспективе начинает обнаруживаться для T ≥ 25 ° C с широкими изменениями, соответствующими вариациям в несколько градусов, что подчеркивает точную температурную чувствительность.При 35 ° C коэффициент пропускания падающего света для тканей, изначально запрограммированных на 80 мДж / см ² , увеличивается до ΔTr ~ 30% (черные точки на рис. 1d), в то время как коэффициент отражения поверхности соответственно уменьшается (белые точки на рис. 1г).

Активация паттерна: морфологические и теоретические исследования

Типичное устройство, отображающее предупреждающий знак при воздействии температуры 55 ° C, сфотографировано в различные моменты времени на левых изображениях на рис. 2a – d (также показан пример перехода. в дополнительном фильме), а соответствующие тепловизионные изображения, полученные с помощью инфракрасной термокамеры, показаны на изображениях справа.Визуальный результат устройства явно основан на контрасте отражательной способности, который возникает при нагревании между областями, которые были или не были ранее экспонированы во время второго этапа фотопрограммирования, соответственно. Экспонированные области остаются беловатыми с высокими значениями отражательной способности, тогда как неэкспонированные области, которые не завершили активацию фотоиндуцированного сшивания, постепенно плавятся в почти сплошную пленку и резко снижают свою отражательную способность, открывая тем самым подложку, используемую для осаждения.Таким образом, TTI использует только окружающий свет без потребности в питании или других источниках света и может отображать любую желаемую форму или узор в зависимости от оптической маски, используемой во втором фотопрограммировании. Интересно, что тепловые изображения на рис. 2b – d подчеркивают, что области, в которых волокна все еще присутствуют (то есть, где отрицательное соединение SU-8 подверглось второму этапу фотопрограммирования), поддерживают локальную температуру значительно ниже (на ∼1 ° C). , Рис. S8), чем области, в которых волокна плавятся и достигается более высокое оптическое пропускание из-за эффективности охлаждения органического нетканого материала, который, вероятно, будет способствовать высоким тепловым потокам ²⁹ .Наилучший вид перехода, которому подвергается нетканый материал при повышении температуры, фиксируется с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), отображающей поверхность раздела двух областей, которые либо экспонированы, либо не экспонированы, во время второго этапа фотопрограммирования. Оптические микрофотографии этой границы раздела, собранные в разные моменты времени, когда TTI выдерживают при 55 ° C, показаны на рис. 2e – h, соответствующие снимки SEM волокнистых поверхностей раздела представлены на рис. 2i – l, а виды при большем увеличении неэкспонированные волокна при плавлении с течением времени показаны на рис.2м – п. Как показано на рис. 2i – l, волокна, экспонированные во время второго фотопрограммирования, вместо этого стабильны в течение исследованного времени, что объясняет различные оптические свойства с микроскопической точки зрения.